Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium trong thực vật | Công nghệ sinh học (Có sơ đồ)

Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium trong thực vật!

Agrobacterium là một loại vi khuẩn gây bệnh gram âm liên quan đến việc gây ra bệnh hình thành túi mật ở các loài thực vật. Sự hình thành túi mật vương miện là do sự chuyển một đoạn DNA gây ung thư (gây ung thư) vào tế bào thực vật tại các vị trí bị thương.

Đoạn DNA này (DNA chuyển hoặc T-DNA) có mặt trên các plasmid lớn gọi là plasmid gây ra khối u (Ti) trong vi khuẩn. T-DNA (dài khoảng 20 kb) được tích hợp vào nhiễm sắc thể thực vật bằng cách tái hợp. Một loạt các gen độc lực (vir) có liên quan đến việc chỉ đạo quá trình lây nhiễm. Vì vậy, khi một rễ cây hoặc thân cây bị thương, nó sẽ cho ra phản ứng nhất định.

Để đáp ứng với những tín hiệu đó, các gen vir của A. tumefactor được kích hoạt và điều khiển một loạt các sự kiện cần thiết để chuyển T-DNA từ plasmid Ti sang nhiễm sắc thể của cây. Chức năng của các gen vir khác nhau bao gồm một bản sao của T-DNA, sau đó gắn sản phẩm vào chuỗi T-DNA được sao chép để hoạt động như một nhà lãnh đạo, sau đó thêm protein cùng với chiều dài của T-DNA, có thể như một sự bảo vệ cơ chế.

Cuối cùng chúng mở một kênh trong màng tế bào vi khuẩn, qua đó T-DNA đi qua. T-DNA sau đó đi vào cây thông qua vết thương. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ làm thế nào DNA vi khuẩn di chuyển từ tế bào chất đến nhân của tế bào thực vật hoặc làm thế nào T-DNA được tích hợp vào nhiễm sắc thể thực vật.

Để sử dụng các vi khuẩn này như một vectơ, vùng T-DNA của nó bị loại bỏ ngoại trừ các vùng biên và gen vir. Chuyển gen sau đó được chèn vào giữa các vùng T-DNA, nơi nó được chuyển đến tế bào thực vật và được tích hợp vào nhiễm sắc thể của cây (Hình 1). T-DNA được nhân bản trong Ti-plasmid, được cắt theo kích thước và được sao chép trong E.coli để tạo điều kiện cho thao tác tiếp theo. Các vectơ này được huy động vào các chủng chủ Agrobacterium và được sử dụng để lây nhiễm các mô thực vật.

Những mô thực vật bị nhiễm bệnh này sau đó được phát triển trên môi trường chứa các hóa chất cụ thể, chất điều chỉnh tăng trưởng để tạo điều kiện cho sự tái tạo của các tế bào biến đổi. Việc lựa chọn các chất chuyển hóa được thực hiện với sự có mặt của một loại kháng sinh có trong môi trường nuôi cấy. Các nhà máy biến đổi cuối cùng được phân tích để tích hợp ổn định và phân tích chức năng của gen được chèn.

Hợp chất Protoplast:

Các tế bào không có thành tế bào được gọi là protoplast. Những nguyên mẫu này có thể hấp thụ DNA trực tiếp với sự có mặt của một số hóa chất (như polyethylen glycol, PEG). Nồng độ PEG cao hơn gây ra sự thẩm thấu của màng plasma, cho phép sự hấp thu DNA vào protoplast. Ngay cả các tín hiệu điện có thể được sử dụng để tạo ra các lỗ nhỏ trên màng plasma bằng cách truyền một dòng điện.

Điều này được gọi là electropising. Những khẩu độ nhỏ này sau đó giúp hấp thu DNA ngoại lai bằng protoplast. Điều này sau đó được theo sau bởi sự hình thành thành tế bào và bắt đầu phân chia tế bào. Tuy nhiên, việc sản xuất cây chuyển gen bằng cách chuyển gen trực tiếp sang protoplast không phụ thuộc vào hệ thống protoplast hiệu quả để tái sinh cây.

Chuyển gen hoặc súng sinh học:

Đây là kỹ thuật gần đây nhất mà người ta có thể đưa DNA quan tâm vào một tế bào bằng cách nạp các hạt vi mô (như vàng hoặc vonfram) với tốc độ cao. Quá trình cung cấp DNA này được gọi là bắn phá. Bên trong tế bào, các phân tử DNA được giải phóng khỏi các hạt và cuối cùng DNA này được tích hợp vào bộ gen hạt nhân hoặc cơ quan của tế bào chủ.

Các mô thực vật cuối cùng được nuôi cấy trên môi trường có chứa các kích thích tố / kháng sinh cụ thể để chọn các cây biến đổi. Khi gen quan tâm được chuyển đến vật chủ mong muốn, sự tích hợp ổn định của nó cần được thiết lập bằng cách tái sinh cây. Điều này đạt được bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.

Quá trình nuôi cấy mô có thể được chia thành bốn giai đoạn:

Giai đoạn I:

Bao gồm việc lựa chọn các nhà thám hiểm phù hợp và chuyển nó vào môi trường dinh dưỡng.

Giai đoạn II:

Bao gồm sự tăng sinh của mô phát triển trên môi trường nhân.

Giai đoạn III:

Bao gồm chuyển mô đang phát triển (mô sẹo) sang môi trường nơi nó có thể phân biệt thành các phần khác nhau của nó.

Giai đoạn IV:

Bao gồm chuyển cây con vào môi trường tự nhiên. Tuy nhiên, các gen quan tâm có thể được thêm vào theo hai cách là định hướng cảm giác và chống lại. Để thể hiện hoặc vượt qua gen người ta có thể đặt gen theo định hướng ý nghĩa. Tuy nhiên, nếu người ta muốn chặn sản phẩm không mong muốn hoặc một bước trong con đường sinh hóa, người ta có thể đặt gen theo hướng chống lại.