Nhằm mục đích phân lập các vi khuẩn khác nhau hiện diện trong một mẫu nhất định và duy trì các nền văn hóa tinh khiết của chúng

Nhằm mục đích phân lập các vi khuẩn khác nhau có trong một mẫu nhất định và duy trì môi trường nuôi cấy tinh khiết của chúng.

Mục đích:

Vi khuẩn được tìm thấy trong tự nhiên, không xuất hiện dưới dạng các loài tách biệt, thay vào đó chúng xuất hiện dưới dạng các quần thể hỗn hợp của các loài khác nhau.

Do đó, để nghiên cứu từng loài vi khuẩn, trước tiên cần phải phân tách chúng khỏi quần thể hỗn hợp. Quá trình này được gọi là "phân lập vi khuẩn".

Nó được thực hiện bằng cách tăng dân số hỗn hợp vi khuẩn trên bề mặt của môi trường rắn thành các khuẩn lạc rời rạc. "Các khuẩn lạc" là những khối vi khuẩn riêng lẻ, có thể nhìn thấy được về mặt vĩ mô được sinh trưởng trên bề mặt của môi trường rắn, mỗi đại diện cho sự nhân lên của một vi khuẩn.

Vì mỗi thuộc địa xuất phát từ sự nhân lên và nhân lên của một loại vi khuẩn, tất cả các vi khuẩn có trong thuộc địa đều thuộc về cùng một loài. Do đó, mỗi thuộc địa đại diện cho một quần thể rất lớn của một loài vi khuẩn.

Các khuẩn lạc này được chuyển vô trùng để tách môi trường thạch dinh dưỡng và được phép phát triển ở đó. Các loài vi khuẩn bị cô lập, được trồng riêng trên môi trường thạch được gọi là "nuôi cấy tinh khiết". Cứ sau 15 đến 30 ngày, chúng được chuyển sang dạng xiên tươi, để chúng không bị mất các đặc tính ban đầu do quá đông, thiếu chất dinh dưỡng và tích lũy các chất chuyển hóa.

Theo cách này, việc nuôi cấy vi khuẩn nguyên chất được duy trì trong phòng thí nghiệm bằng cách chuyển lặp đi lặp lại sang môi trường mới trong khoảng thời gian đều đặn. Quá trình này được gọi là "duy trì văn hóa thuần túy". Nuôi cấy tinh khiết được duy trì trong phòng thí nghiệm để xác định tiếp theo bằng các kỹ thuật nhuộm, sinh hóa, huyết thanh học và phân tử khác nhau cũng như để sử dụng trong tương lai.

"Văn hóa chứng khoán" là các nền văn hóa thuần túy tiêu chuẩn, có sự nhận dạng đã được thiết lập trên phạm vi quốc tế đối với các chi, loài, loài phụ, loại hoặc cấp độ phụ. Chúng được duy trì trong các phòng thí nghiệm vi sinh được quốc tế công nhận.

Các phòng thí nghiệm khác có thể lấy chúng từ các phòng thí nghiệm này và duy trì trong phòng thí nghiệm của chính họ như là nền văn hóa chứng khoán của họ, bằng cách chuyển lặp đi lặp lại sang các xiên mới đều đặn. Chúng được sử dụng để xác nhận các mẫu nuôi cấy tinh khiết thu được trong các phòng thí nghiệm này bằng cách so sánh các đặc điểm của chúng với các mẫu nuôi cấy chuẩn.

Nguyên tắc:

Quần thể vi khuẩn hỗn hợp có trong một vật liệu nhất định (rắn, lỏng hoặc bề mặt) được nuôi cấy trên các đĩa thạch dinh dưỡng bằng phương pháp tấm trải hoặc tấm sọc như mô tả trước đây trong 'Nuôi cấy vi khuẩn'. Mỗi thuộc địa biệt lập được tìm thấy trên đĩa thạch bao gồm một loài vi khuẩn, vì mỗi thuộc địa phát triển từ một vi khuẩn.

Do đó, vi khuẩn được phân lập trên đĩa thạch bằng hai kỹ thuật như sau:

(a) Kỹ thuật tấm trải

(b) Kỹ thuật tấm sọc

Các khuẩn lạc đại diện (các khuẩn lạc có đặc điểm không giống nhau) được chọn và tiêm vô trùng để tách môi trường thạch để có được các nền văn hóa thuần túy. Sau mỗi 15 đến 30 ngày, chúng được chuyển sang các khu vực tươi mới để duy trì các nền văn hóa thuần túy này.

Vật liệu thiết yếu:

Các ống nghiệm (5 nos.), Bình nón 250 ml (1 không), NaOH 0, 1N, HCI 0, 1N, nước cất, agar dinh dưỡng, bông không thấm nước, vòng lặp, giấy thủ công, chỉ (hoặc băng cao su), giấy pH (hoặc máy đo pH), đầu đốt bunsen, nồi hấp, buồng chảy tầng, lò ấp, đĩa chứa khuẩn lạc phân lập của vi khuẩn (tấm trải hoặc tấm sọc).

Thủ tục:

1. Các thành phần của môi trường thạch dinh dưỡng hoặc bột làm sẵn cần cho 100 ml môi trường được cân và hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml bằng cách lắc và xoay (Hình 6.4).

2. Độ pH của nó được xác định bằng cách sử dụng giấy pH hoặc máy đo pH và điều chỉnh thành 7, 0 bằng HCN 0, 1N nếu nhiều hơn hoặc sử dụng NaOH 0, 1N nếu ít hơn.

3. Bình được đun nóng để hòa tan hoàn toàn agar trong môi trường.

4. Trước khi nó đông cứng, môi trường trong điều kiện nóng chảy ấm được phân phối vào 5 ống nghiệm (mỗi ống khoảng 20 ml).

5. Các ống nghiệm được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

6. Chúng được khử trùng ở 121 ° C (áp suất 15 psi) trong 15 phút trong nồi hấp.

7. Sau khi khử trùng, chúng được lấy ra khỏi nồi hấp và giữ ở vị trí nghiêng để làm mát và hóa rắn môi trường. Những ống nghiệm chứa môi trường thạch dinh dưỡng đông đặc trong điều kiện nghiêng được gọi là "môi trường thạch dinh dưỡng".

8. Bước 10 và 11 nên được thực hiện theo kỹ thuật vô trùng tốt nhất là trong buồng dòng chảy tầng. Miệng của các vật chứa có chứa môi trường hoặc môi trường tiệt trùng phải được thể hiện trên ngọn lửa của đầu đốt bunsen sau khi tháo phích cắm bông và trước khi đặt lại.

Vòng lặp, trước khi sử dụng phải được khử trùng trên ngọn lửa bằng cách đun nóng đến nóng đỏ và sau đó làm mát trong 30 giây để làm mát đến nhiệt độ phòng. Chúng không bao giờ được sử dụng khi rất nóng, vì chúng tiêu diệt vi khuẩn khi chạm vào chúng.

9. Trong thí nghiệm trước, nếu các khuẩn lạc biệt lập có thể được quan sát trên tấm trải hoặc tấm sọc, năm khuẩn lạc có đặc điểm không giống nhau được chọn làm khuẩn lạc đại diện.

10. Một vòng lặp được khử trùng trên ngọn lửa và một vòng vi khuẩn từ mỗi thuộc địa đại diện được lấy một cách vô trùng. Vòng lặp được đưa vào xiên agar, để vòng lặp của vi khuẩn đi đến cuối xiên. Vòng lặp được di chuyển ra ngoài theo cách lượn sóng chạm vào bề mặt của xiên, do đó một đường lượn sóng được hình thành.

11. Vòng lặp được khử trùng bằng ngọn lửa và theo cách tương tự, phần còn lại của bốn thuộc địa đại diện được cấy riêng rẽ vào bên trái trên bốn góc nghiêng. Các vòng lặp được khử trùng sau mỗi lần tiêm chủng.

12. Năm môi trường cấy được ủ ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm.

Quan sát (Đặc điểm văn hóa):

(i) Một đường lượn sóng với sự tăng trưởng dọc theo chiều dài của nó được quan sát:

Tăng trưởng đã diễn ra.

Độ nghiêng được quan sát cho các đặc điểm nghiêng như sau (Hình 6.5).

1. Sự phong phú của tăng trưởng:

Số lượng tăng trưởng được chỉ định là không, nhẹ, trung bình hoặc lớn.

2. Sắc tố:

Các vi sinh vật nhiễm sắc thể có thể tạo ra các sắc tố nội bào chịu trách nhiệm cho màu sắc của sinh vật như nhìn thấy trong các khuẩn lạc bề mặt. Các sinh vật khác tạo ra các sắc tố hòa tan ngoại bào được bài tiết vào môi trường và cũng tạo ra màu sắc. Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật là không nhiễm sắc thể và sẽ xuất hiện màu trắng sang màu xám.

3. Đặc điểm quang học:

Các đặc tính quang học có thể được đánh giá trên cơ sở lượng ánh sáng truyền qua sự tăng trưởng.

Những đặc điểm này được mô tả là:

(a) Opaque: Không truyền ánh sáng.

(b) Dịch: Truyền ánh sáng một phần.

4. Hình thức:

Sự xuất hiện của vệt tăng trưởng đơn trên bề mặt thạch được chỉ định như sau:

(a) Filiform: Liên tục, tăng trưởng như sợi với các cạnh mịn.

(b) Echinulation: Tăng trưởng liên tục, giống như ren với các cạnh không đều.

(d) Nỗ lực: Mỏng, tăng trưởng lan rộng.

(e) Arborescent: Tăng trưởng giống như cây.

(f) Rhizoid: Tăng trưởng giống như rễ.

(ii) Không tăng trưởng theo dòng tiêm chủng:

Kỹ thuật tiêm chủng, tiêm chủng được lặp lại C Enumulation of Vi khuẩn.

C. Liệt kê vi khuẩn:

Mức độ hoạt động của vi khuẩn trong một mẫu nhất định trong một tập hợp các điều kiện xác định chủ yếu phụ thuộc vào tổng số vi khuẩn có trong đó không phân biệt loài của chúng. Do đó, rất thường xuyên phải tìm ra tổng số vi khuẩn có trong các mẫu thực phẩm, nước, đất, không khí và mô trong quá trình phân tích vi sinh.

Ước tính số lượng vi khuẩn trong một mẫu nhất định được gọi là 'liệt kê vi khuẩn'. Có nhiều phương pháp liệt kê vi khuẩn như được đưa ra dưới đây. Tất cả các phương pháp này cần vi khuẩn có mặt trong huyền phù đồng nhất.

Đó là lý do tại sao các mẫu chất lỏng được coi là huyền phù đồng nhất của vi khuẩn và được sử dụng trực tiếp, trong khi các mẫu rắn được đồng nhất hóa trong dung dịch muối vô trùng, để có được huyền phù đồng nhất của vi khuẩn.

Không được sử dụng phổ biến:

(I) Phương pháp trực tiếp:

(a) Số lượng kính hiển vi trực tiếp

(b) Bộ đếm tế bào điện tử

(II) Phương pháp gián tiếp:

(d) Phương pháp đo độ đục

(e) Số lượng bộ lọc màng

Được sử dụng rộng rải nhất:

(f) Phương pháp mạ pha loãng nối tiếp hoặc Phương pháp đếm tổng tấm (phương pháp TPC)

(a) Đếm kính hiển vi trực tiếp:

Trong phương pháp này, số lượng vi khuẩn có trong một dịch huyền phù của vi khuẩn đồng nhất được đếm trực tiếp dưới kính hiển vi và tổng số vi khuẩn trong mẫu được xác định theo toán học.

Ưu điểm của phương pháp này là, nó rất nhanh. Nhược điểm là, cả tế bào sống (khả thi) và tế bào chết đều được tính và phương pháp này không nhạy cảm với quần thể dưới một triệu vi khuẩn trên mililit.

Đếm có thể được thực hiện theo hai phương pháp như sau:

(i) Phòng Petroff-Hauser:

Đây là một buồng đếm chuyên dụng, trong đó một phần của huyền phù đồng nhất của vi khuẩn được đặt để đếm trực tiếp dưới kính hiển vi.

(ii) Smear giống:

Các tế bào vi khuẩn được đếm trực tiếp dưới kính hiển vi bằng cách sử dụng các vết bẩn được giới hạn trong khu vực 1 mm ² trên phiến kính. Nó chủ yếu được sử dụng để liệt kê vi khuẩn trong sữa.

(b) Bộ đếm tế bào điện tử:

Một bộ đếm tế bào điện tử như 'Bộ đếm Coulter' được sử dụng để đếm trực tiếp số lượng tế bào vi khuẩn. Một sự đình chỉ đồng nhất của các tế bào vi khuẩn được chuẩn bị trong một chất lỏng dẫn điện được phép đi qua một lỗ nhỏ, qua đó một dòng điện chạy qua.

Điện trở tại lỗ được ghi lại bằng điện tử. Khi một tế bào đi qua lỗ, không phải là chất dẫn điện, nó sẽ tăng sức đề kháng trong giây lát. Số lần kháng thuốc tăng trong giây lát được ghi lại bằng điện tử, cho biết số lượng vi khuẩn có trong huyền phù.

Ưu điểm của phương pháp này là, nó cực kỳ nhanh chóng. Nhược điểm là, cả tế bào sống (khả thi) và tế bào chết đều được tính và dụng cụ không thể phân biệt giữa tế bào vi khuẩn và vật chất hạt trơ.

(c) Phương pháp hóa học:

Những phương pháp này ước tính số lượng của các chất đó, chủ yếu là hóa chất, tăng theo sự gia tăng dân số vi khuẩn.

Các tham số chính được ước tính như sau:

(i) Nồng độ protein

(ii) nồng độ DNA

(iii) Trọng lượng khô

(iv) Sản xuất carbon dioxide

(v) Hấp thụ oxy

(vi) Sản xuất axit lactic

(d) Phương pháp Turbidimetric:

Khi vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng (ví dụ môi trường dinh dưỡng), sự phát triển mạnh mẽ của chúng làm cho môi trường trở nên đục, vì các tế bào vi khuẩn hầu hết vẫn lơ lửng trong đó. Độ đục tăng khi tăng số lượng tế bào trong môi trường. Khi độ đục tăng, 'độ hấp thụ' hoặc 'mật độ quang (OD)' của phương tiện truyền thông tăng.

OD của huyền phù tế bào vi khuẩn trong môi trường được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 600nm. Số lượng tế bào vi khuẩn trong huyền phù được tìm ra bằng cách so sánh OD với một đường cong chuẩn được chuẩn bị bằng cách vẽ các giá trị OD cho các nồng độ vi khuẩn đã biết khác nhau. Phương pháp này nhanh chóng, nhưng giới hạn ở huyền phù vi khuẩn của hơn 10 triệu tế bào.

(e) Bộ lọc màng:

Phương pháp này được sử dụng, khi số lượng vi khuẩn trong một mẫu chất lỏng rất ít. Để tăng nồng độ vi khuẩn, đầu tiên mẫu chất lỏng được lọc vô trùng thông qua thiết bị lọc màng khử trùng bằng bộ lọc màng vô trùng.

Bộ lọc màng chứa vi khuẩn bị mắc kẹt được chuyển vô trùng vào đĩa petri vô trùng có chứa một miếng thấm được bão hòa với môi trường chất lỏng chọn lọc. Môi trường chảy ra trên bề mặt của bộ lọc. Sau khi ủ, số lượng khuẩn lạc hình thành trên bộ lọc được đếm bằng kính hiển vi đơn giản.