Nuôi cấy vi khuẩn từ các mẫu rắn, lỏng và tăm bông (có hình)

Mục đích:

Mục đích chính của việc nuôi cấy vi khuẩn như sau:

1. Tăng số lượng vi khuẩn, để có được chúng ở dạng có thể nhìn thấy, như là khuẩn lạc hoặc huyền phù.

2. Phân lập vi khuẩn.

3. Duy trì văn hóa chứng khoán thuần túy và văn hóa tiêu chuẩn.

4. Liệt kê vi khuẩn trong mẫu.

5. Phát hiện vi khuẩn đặc biệt quan tâm trong một mẫu và liệt kê của nó.

6. Xác định vi khuẩn từ đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng trên môi trường và hoạt động sinh hóa trong các môi trường khác nhau.

Tuy nhiên, mục đích của thí nghiệm này chỉ là nuôi cấy vi khuẩn từ các mẫu lỏng, rắn và bề mặt trong môi trường rắn và lỏng, để có được chúng ở dạng có thể nhìn thấy dưới dạng khuẩn lạc hoặc huyền phù.

Nguyên tắc:

Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường chất lỏng hoặc chất rắn giàu dinh dưỡng. Môi trường lỏng, được gọi là nước dùng, được chứa trong các ống nghiệm để tạo thành 'ống canh', trong khi môi trường rắn, được gọi là môi trường thạch, được chứa trong các đĩa petri để tạo thành 'đĩa thạch' hoặc đơn giản là 'đĩa'. Nuôi cấy vi khuẩn cần một số vật liệu, nghi ngờ có chứa vi khuẩn.

Hầu hết những thứ chúng ta thấy có chứa vi khuẩn. Chúng có mặt trong cạo răng, thức ăn, đất, nước, phân và thậm chí trong các phương tiện vi sinh vật không được khử trùng. Một lượng nhất định huyền phù đồng nhất của bất kỳ vật liệu có chứa vi khuẩn nào được cấy vào môi trường khử trùng vô trùng và ủ trong tủ ấm ở 37 ° C trong 24 giờ.

Trong nước dùng lỏng, vi khuẩn phát triển như huyền phù và làm cho nó đục. Trên đĩa thạch rắn, chúng phát triển như những khuẩn lạc; mỗi thuộc địa phát triển từ một vi khuẩn duy nhất. Nuôi cấy vi khuẩn được thực hiện trong năm bước sau đây.

1. Chuẩn bị phương tiện truyền thông

2. Khử trùng môi trường và đồ thủy tinh

3. Cấy

4. Ủ

5. Quan sát

1. Chuẩn bị phương tiện truyền thông:

Thông thường, trong việc chuẩn bị nước dùng lỏng và môi trường semisolid, các thành phần được cân theo tỷ lệ quy định và hòa tan trong lượng nước cần thiết. Hiện nay, bột phương tiện làm sẵn có chứa các thành phần theo tỷ lệ cần thiết có sẵn.

Để chuẩn bị môi trường môi trường lỏng, lượng bột quy định (như đã đề cập trên nhãn của gói) được cân và hòa tan trong lượng nước cần thiết trong bình nón. Các thành phần được hòa tan bằng cách làm ấm, đổ vào ống nghiệm và khử trùng trong nồi hấp.

Nhưng để chuẩn bị các tấm rắn, xiên và ống sâu, lượng bột quy định (như đã đề cập trên nhãn của gói) được cân và hòa tan trong lượng nước cần thiết trong bình nón. Môi trường chuẩn bị này đầu tiên được khử trùng trong nồi hấp và sau đó để nguội một thời gian.

Trong khi vẫn còn ấm, trước khi nó đông cứng, nó được đổ vào đĩa Petri tiệt trùng hoặc ống nghiệm và cho phép hóa rắn khi làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Phương tiện, trong điều kiện rất nóng không bao giờ được đổ vào các thùng chứa, vì nó dẫn đến sự ngưng tụ nước trên thành của các thùng chứa, rơi trên bề mặt của phương tiện truyền thông và có thể dẫn đến ô nhiễm của nó.

2. Khử trùng:

Dụng cụ thủy tinh được khử trùng trong lò không khí nóng ở 180 ° C trong 3 giờ và môi trường trong nồi hấp ở 121 ° C (áp suất 15 psi) trong 15 phút. Đồ thủy tinh cũng có thể được khử trùng trong nồi hấp, nhưng phương tiện không bao giờ được khử trùng trong lò, vì nước thoát ra khỏi phương tiện và chúng bị mất nước.

3. Cấy:

Các mẫu chất lỏng được coi là huyền phù đồng nhất của vi khuẩn. Do đó, đối với canh tác trong môi trường canh, một khối lượng nhất định của mẫu được đổ vào nước dùng một cách vô trùng. Đối với canh tác trên các tấm thạch, một thể tích xác định của mẫu được đổ vào tấm thạch rắn và trải đều trên bề mặt của môi trường vô trùng.

Đối với các mẫu rắn, một mẫu có trọng lượng xác định được đồng nhất hóa vô trùng trong một thể tích xác định của nước muối sinh lý bình thường (0, 85% natri clorua) bằng chày và cối tiệt trùng hoặc máy xay sinh tố. Hầu hết các mầm bệnh ở người là đồng vị với cơ thể người (0, 85% natri clorua).

Thông thường tỷ lệ mẫu trong nước muối là 1: 9 (1g + 9 ml; 10g + 90 ml; 25g + 225 ml hoặc 50g + 450 ml). Một thể tích xác định của chất lỏng đồng nhất này, được coi là huyền phù đồng nhất của vi khuẩn, được dẫn vô trùng vào nước dùng tiệt trùng trong ống nghiệm để nuôi cấy nước dùng. Đối với nuôi cấy trên các tấm thạch, huyền phù lỏng được bơm lên bề mặt của các tấm và lan truyền vô trùng.

Đối với các mẫu bề mặt được lấy để nghiên cứu vi sinh học của các bề mặt rắn (mặt bàn, bề mặt cơ thể hoặc vết thương), bề mặt được chà bằng tăm bông tiệt trùng. Gạc được chạm vào bề mặt của đĩa thạch tiệt trùng. Từ điểm chạm, các vệt được tạo ra bằng vòng khử trùng vô trùng, để phân lập vi khuẩn.

4. Ủ trứng:

Các ống và đĩa nuôi cấy được ủ ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm.

5. Quan sát:

Độ đục trong nước dùng lỏng và khuẩn lạc trên đĩa thạch cho thấy sự phát triển của vi khuẩn.

Vật liệu cần thiết:

Đĩa Petri (6 nos.), Pipet 2 ml (5 nos.), Ống nghiệm (5 nos.), Bình nón (mỗi loại 100 ml, 250ml và 500ml), cốc 250 ml (2 nos.), Thủy tinh máy rải, vỏ pipet inox, giấy thủ công, chỉ (hoặc dây cao su), bông không thấm nước, que nhỏ, vòng, rượu ethyl, natri clorua (NaCl), axit clohydric 0, 1N (HCI), natri hydroxit 0, 1N (NaOH ), nước cất, nước canh dinh dưỡng, môi trường dinh dưỡng, mẫu chất lỏng (ví dụ nước ao), mẫu rắn (ví dụ đất), mẫu bề mặt (ví dụ mặt bàn, bề mặt cơ thể, vết thương), giấy pH (hoặc máy đo pH), chày và vữa (hoặc homogeniser), lò đốt bunsen, lò không khí nóng, nồi hấp, lò ấp, buồng chảy tầng.

Thủ tục:

1. Năm pipet (trong hộp bằng thép không gỉ), sáu đĩa petri và một cặp chày và cối (hoặc một cốc homogeniser) được khử trùng ở 180 ° C trong 3 giờ trong lò không khí nóng. Ngoài ra, chúng có thể được phủ bằng giấy thủ công, buộc bằng chỉ hoặc dây cao su và khử trùng trong nồi hấp cùng với phương tiện truyền thông (Hình 6.1).

2. 0, 85 g NaCl được hòa tan trong 100 ml nước cất trong cốc 250 ml và 90 ml dung dịch muối này được đổ vào bình nón 100 ml. Miệng được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

3. Các thành phần của môi trường nước canh dinh dưỡng cần thiết cho 100 ml nước dùng được cân. Ngoài ra, số lượng quy định của bột canh dinh dưỡng làm sẵn (hỗn hợp thành phần) được cân.

4. Các thành phần (hoặc bột làm sẵn) được hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml bằng cách lắc và xoáy. Độ pH của nó được xác định bằng cách sử dụng giấy pH hoặc máy đo pH. Độ pH được điều chỉnh thành 7, 0 bằng HCN 0, 1N nếu nhiều hơn hoặc sử dụng NaOH 0, 1N nếu ít hơn. Bình được làm nóng, nếu cần, để hòa tan hoàn toàn các thành phần.

5. Nước dùng được phân phối thành 5 ống nghiệm (mỗi ống khoảng 10 ml), miệng của chúng được cắm bằng bông, được phủ bằng giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

6. Các thành phần của môi trường thạch dinh dưỡng hoặc bột làm sẵn cần cho 200 ml môi trường được cân và hòa tan trong 200 ml nước cất trong bình nón 500 ml bằng cách lắc và xoay.

Độ pH của nó được xác định bằng cách sử dụng giấy pH hoặc máy đo pH và điều chỉnh thành 7, 0 bằng HCN 0, 1N nếu nó nhiều hơn hoặc sử dụng NaOH 0, 1N nếu ít hơn. Bình được đun nóng để hòa tan agar trong môi trường hoàn toàn. Sau đó, nó được cắm bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

7. Gạc được thực hiện bằng cách xoắn bông xung quanh đầu que nhỏ. Vài miếng gạc như vậy được giữ trong ống nghiệm với đầu bông hướng xuống dưới. Ống nghiệm được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

8. Bình nón 100 ml với nước muối 90 ml, 5 ống nghiệm có nước canh dinh dưỡng, bình nón 500 ml chứa môi trường thạch dinh dưỡng 200 ml và ống nghiệm chứa gạc được khử trùng ở 121 ° C (áp suất 15 psi) cho 15 phút trong nồi hấp.

9. Sau khi khử trùng, các vật liệu tiệt trùng được lấy ra khỏi nồi hấp và để nguội trong một thời gian, mà không cho phép môi trường hóa rắn. Làm mát môi trường ngăn chặn sự ngưng tụ và tích tụ các giọt nước bên trong các tấm. Nếu môi trường đã được chuẩn bị và hóa rắn trong quá trình bảo quản, nó phải được hóa lỏng bằng cách đun nóng cẩn thận cho đến khi nó tan chảy hoàn toàn.

10. Để chuẩn bị các đĩa thạch dinh dưỡng, trước khi môi trường thạch dinh dưỡng tiệt trùng nguội đi và đông cứng lại, trong điều kiện nóng chảy, nó được đổ vô trùng, vào 6 đĩa petri đã khử trùng (mỗi đĩa khoảng 20 ml), để môi trường nóng chảy bao phủ đáy. Các món ăn petri hoàn toàn.

Sau đó, các tấm được phủ bằng nắp đậy của chúng và để nguội, để làm cứng môi trường trong đó. Hơi nước có thể ngưng tụ trên bề mặt bên trong của các tấm và nắp được bốc hơi bằng cách giữ các tấm và nắp ở vị trí đảo ngược trong tủ ấm ở 37 ° C trong khoảng 1 giờ.

11. Mẫu chất lỏng (nghi ngờ có chứa vi khuẩn, ví dụ như nước ao) được lấy. Một ml mỗi mẫu được bơm vô trùng vào 2 ống canh (Hình 6.2). Các ống bị xoáy. Mẫu chất lỏng cũng được bơm vô trùng vào 2 đĩa thạch, mỗi đĩa 0, 1 ml và trải đều trên bề mặt môi trường thạch bằng máy rải thủy tinh tiệt trùng bằng ngọn lửa.

Trước mỗi lần rải bằng máy rải thủy tinh, nó được nhúng vào cồn và đốt trên một lò đốt bunsen. Các ống và đĩa nuôi cấy được ủ ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm. Các tấm được ủ ở vị trí đảo ngược, từ trên xuống.

12. Đối với mẫu rắn (ví dụ như đất), 10g mẫu được cân vô trùng và đồng nhất trong chày đã khử trùng và cốc hoặc cốc đồng nhất sau khi thêm 90 ml nước muối tiệt trùng từ bình nón 100 ml.

Huyền phù vi khuẩn đồng nhất này được vô trùng hóa vào 2 ống nước canh và 2 đĩa thạch như ở bước 11 và ủ ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm (Hình 6.2). Các tấm được ủ ở vị trí đảo ngược, từ trên xuống.

13. Để lấy mẫu bề mặt, bề mặt nghi ngờ có chứa vi khuẩn (mặt bàn, bề mặt cơ thể, vết thương) được đánh dấu cho một đơn vị diện tích (ví dụ 1 cm ² ), được chà bằng tăm bông tiệt trùng. Gạc được chạm vào bề mặt của hai tấm thạch trái.

Streaking được thực hiện vô trùng bằng một vòng khử trùng ngọn lửa. Đối với sọc, các đường gần như song song được vẽ bởi vòng lặp từ điểm chạm swab. Chúng tạo thành các vệt chính. Sau khi khử trùng ngọn lửa của vòng lặp, các vệt thứ cấp được vẽ gần như theo đường chéo với các vệt chính. Theo cách tương tự, các vệt bậc ba và bậc bốn được tạo ra một cách vô trùng.

14. Sau đó, các tấm được ủ ở vị trí đảo ngược, từ trên xuống, ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm (Hình 6.2).

15. Một đĩa thạch không được khử trùng và một ống nước canh không được khử trùng được ủ dưới dạng đối chứng để đảm bảo khử trùng đúng cách được chỉ định bởi không có sự tăng trưởng trong chúng. Bước này là tùy chọn.