Thử nghiệm deoxyribonuclease trên vi khuẩn để tìm ra khả năng của chúng đối với DNA thủy phân (có hình)

Xét nghiệm deoxyribonuclease (Thử nghiệm DNase) trên Vi khuẩn để tìm ra Khả năng của chúng để thủy phân DNA (Có Hình)!

Nguyên tắc:

Một số vi khuẩn có khả năng thủy phân axit deoxyribonucleic (DNA) thành oligonucleotide, vì chúng có thể tạo ra enzyme thủy phân ngoại bào 'deoxyribonuclease' (DNase).

Trong khi DNA bị kết tủa bởi axit hydrochloric tạo ra độ mờ, các sản phẩm cuối bị thủy phân, oligonucleotide, không bị kết tủa bởi axit hydrochloric, do chúng không tạo ra độ mờ như vậy; thay vì sản xuất minh bạch.

Trong thử nghiệm DNase, vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch chứa DNA. Sau khi các khuẩn lạc của vi khuẩn được nhìn thấy, các tấm được ngập trong axit clohydric. Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân DNA, các khuẩn lạc của nó sẽ thủy phân DNA trong môi trường ở các khu vực xung quanh chúng, trong khi các khu vực còn lại của các đĩa chứa DNA không được thủy phân.

Kết quả là, khi ngập axit clohydric, các vùng trong suốt được hình thành xung quanh các khuẩn lạc, vì các sản phẩm thủy phân, oligonucleotide, được hình thành xung quanh chúng không tạo thành kết tủa với axit hydrochloric.

Mặt khác, phần còn lại của các mảng trở nên mờ đục, vì DNA không được thủy phân trong các khu vực này tạo thành kết tủa với axit hydrochloric. Nếu màu xanh toluidine được sử dụng thay cho axit hydrochloric, một quầng hồng màu hồng chỉ được tạo ra xung quanh các khuẩn lạc.

Vật liệu thiết yếu:

Đĩa Petri, bình nón, phích cắm bông, vòng cấy, nồi hấp, lò đốt bunsen, buồng chảy tầng, bình vứt, máy ấp trứng, agase agar, axit hydrochloric IN (hoặc 0, 1% màu xanh lam của vi khuẩn

Thủ tục:

1. Hai đĩa petri được làm sạch, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su (Hình 7.23). Bước này cũng như khử trùng các đĩa petri ở bước 6 được bỏ qua, nếu các đĩa petri tiệt trùng bằng lò được sử dụng trực tiếp.

2. Các thành phần của môi trường thạch DNase (chứa DNA là thành phần chính) hoặc bột làm sẵn cần cho 100 ml môi trường được cân và hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml bằng cách lắc và xoáy.

3. Độ pH của nó được xác định bằng cách sử dụng giấy pH hoặc máy đo pH và được điều chỉnh thành 7, 2 bằng HCI 0, 1N nếu nhiều hơn hoặc sử dụng NaOH 0, 1N nếu ít hơn.

4. Bình được đun nóng để hòa tan hoàn toàn agar trong môi trường.

5. Bình được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

6. Hai đĩa petri và bình nón chứa môi trường thạch DNase được khử trùng ở 121 ° C (áp suất 15 psi) trong 15 phút trong nồi hấp.

7. Sau khi khử trùng, chúng được lấy ra khỏi nồi hấp và để nguội trong một thời gian, mà không cho phép môi trường hóa rắn. Làm mát môi trường ngăn chặn sự ngưng tụ và tích tụ các giọt nước bên trong các tấm. Nếu môi trường đã được chuẩn bị và hóa rắn trong quá trình bảo quản, nó phải được hóa lỏng bằng cách đun nóng cẩn thận cho đến khi nó tan chảy hoàn toàn.

8 môi trường nóng chảy bao phủ hoàn toàn dưới cùng của đĩa petri.

Sau đó, các tấm được phủ bằng nắp đậy của chúng và để nguội, để làm cứng môi trường trong đó. Hơi nước có thể ngưng tụ trên bề mặt bên trong của các tấm và nắp được bốc hơi bằng cách giữ các tấm và nắp ở vị trí đảo ngược trong tủ ấm ở 37 ° C trong khoảng 1 giờ.

9. Mỗi tấm được đánh dấu ở phía dưới thành bốn phần tư.

10. Cấy vi khuẩn tại chỗ của vi khuẩn thử nghiệm được thực hiện một cách vô trùng, tốt nhất là bên trong buồng chảy tầng, ở trung tâm của mỗi quý bằng cách tạo một đốm (hoặc vết nhỏ) của vi khuẩn với sự trợ giúp của vòng khử trùng ngọn lửa. Các vòng lặp được khử trùng sau mỗi lần tiêm chủng.

11. Các đĩa được cấy được ủ ở vị trí đảo ngược, từ trên xuống, ở 37 ° C trong 24 đến 48 giờ trong tủ ấm cho đến khi nhìn thấy các khuẩn lạc của vi khuẩn.

12. Các tấm được ngập trong dung dịch axit clohydric 1 N (hoặc 0, 1% màu xanh toluidine).