Tái tạo DNA: Cơ chế sao chép DNA

Một số chế độ sao chép DNA quan trọng nhất như sau!

Sự sao chép DNA ở sinh vật nhân chuẩn là bán tự động, bán không liên tục và hai chiều so với bán tự động, hai chiều và liên tục ở sinh vật nhân sơ.

Hình ảnh lịch sự: dbrier.com/tutorials/wp-content/uploads/2012/12/DNA_Vplication_split.png

Sự sao chép DNA xảy ra trong giai đoạn S của chu kỳ tế bào. Đây là một quá trình phức tạp gồm nhiều yếu tố đòi hỏi hơn một chục yếu tố enzyme và protein. Nó bắt đầu tại một vị trí cụ thể được gọi là nguồn gốc của sao chép hoặc ori. DNA của vi khuẩn và virus có một nguồn gốc duy nhất là sao chép. Nó hoạt động như một đơn vị sao chép hoặc bản sao duy nhất.

Trong DNA sinh vật nhân chuẩn có một số nguồn gốc của sự sao chép. Nó có một số phân đoạn sao chép hoặc bản sao, tức là multirepliconic. Trong trường hợp không có ori, nhân rộng sẽ không xảy ra. Yêu cầu của một vectơ cho công nghệ DNA tái tổ hợp là để có được nguồn gốc của sự sao chép.

Sao chép DNA rất tốn kém về năng lượng. Enzym chính của sự sao chép DNA là DNA polymerase phụ thuộc DNA. Sao chép DNA khá nhanh. Việc sao chép DNA của E. coli với 4, 6 x 10 ⁶ bp cần 19 phút.

Trên tốc độ trùng hợp trung bình của các bazơ là 2000 bp mỗi giây theo mỗi hướng. Sự tái tạo đòi hỏi năng lượng dồi dào đến từ sự phân hủy triphosphate của deoxyribonucleotide.

Việc nhân rộng diễn ra như sau:

1. Kích hoạt Deoxyribonucleotide:

Deoxyribonucleotide hoặc deoxyribonucleoside monophosphates xảy ra tự do bên trong nucleoplasm. Chúng có bốn loại, de de de dadadosine monophosphate), deGMP (deoxyarchosine monophosphate), deCMP (deoxycytidine monophosphate) và deTMP (deoxythymidine monophosphate). Chúng được phosl hóa đầu tiên và thay đổi thành các dạng hoạt động có ba dư lượng phốt phát thay vì một. Enzyme phosphorylase là cần thiết cùng với năng lượng.

Các nucleotide phosphoryl hóa là deATP (deoxyadenosine triphosphate), deGTP (deoxyguanosine triphosphate), deCTP (deoxycytidine triphosphate) và deTTP (deoxythymidine triphosphate). Những triphosphate của các cơ sở phục vụ mục đích kép. Chúng hoạt động như cơ chất cũng như cung cấp năng lượng cho phản ứng trùng hợp các nucleotide.

2. Phơi nhiễm sợi DNA:

Enzyme helicase (relaxase) hoạt động trên trang web của Ori và unzips (thư giãn) hai chuỗi DNA bằng cách phá hủy các liên kết hydro. Các chuỗi riêng biệt được ổn định bằng các protein liên kết đơn (SS BPs) hoặc protein ổn định xoắn. Unwinding tạo ra sức căng ở phần không được bọc bằng cách tạo ra nhiều siêu tụ điện. Căng thẳng được giải phóng bởi enzyme topoisomeraes.

Chúng gây ra biệt danh và nối lại chuỗi DNA. Cùng với topoisomerase, vi khuẩn sở hữu một loại enzyme khác gọi là DNA gyrase có thể giới thiệu các siêu tụ âm (người lao động lớn tuổi tin rằng gyword có chức năng cả helicase và topoisomerase).

Với sự trợ giúp của các enzyme khác nhau, cả hai chuỗi DNA trở nên mở để sao chép. Tuy nhiên, toàn bộ DNA không mở trong một lần do yêu cầu năng lượng rất cao. Điểm phân tách tiến triển chậm về phía cả hai hướng. Trong mỗi hướng, nó cho sự xuất hiện của cấu trúc hình chữ Y được gọi là ngã ba nhân rộng (Hình 6.13 và 6.14).

3. Sơn lót RNA:

Nó là điều cần thiết để bắt đầu chuỗi DNA mới. RNA primer là một chuỗi nhỏ RNA được tổng hợp ở đầu 5 of của chuỗi DNA mới với sự trợ giúp của enzyme RNA polymerase đặc hiệu DNA được gọi là primase. RNA primer được hình thành ở đầu tự do của một sợi và đầu cuối của sợi kia. Sự hình thành mồi RNA tạo thành giai đoạn bắt đầu tổng hợp DNA vì không có sự hiện diện của mồi RNA, dna polymerase không thể thêm nucleotide.

Một loại enzyme phức tạp hơn gọi là primo, một số được yêu cầu trong phage ф x 174 và một số hệ thống prokaryote khác. Ở sinh vật nhân chuẩn, chức năng của primase được thực hiện bởi enzyme DNA polymerase α. Nó xây dựng ~ 10 RNA cơ sở và 20-30 cơ sở DNA (Lewin, 2004). Sau khi bắt đầu chuỗi nucleotide, RNA primer được loại bỏ và khoảng trống được lấp đầy bởi DNA polymerase I trong prokaryote và DNA polymerase trong sinh vật nhân chuẩn.

4. DNA polymerase:

Prokaryote có ba loại enzyme tổng hợp DNA chính gọi là DNA polymerase III, II và I. Tất cả chúng đều bổ sung nucleotide theo hướng 5 '-> 3 on trên 3 -> 5 ′ của sợi bố mẹ. Chúng cũng có hoạt động 3 '-> 5 ′ exo-nuclease. Trong khi DNA polymerase III chủ yếu liên quan đến sự sao chép DNA (bổ sung và trùng hợp các bazơ mới), polymerase I là enzyme sửa chữa chính. Polymerase II là enzyme sửa chữa nhỏ.

DNA polymerase I cũng có hoạt động 5 -> 3 exonuclease. Ở sinh vật nhân chuẩn, người ta tìm thấy năm loại polymerase DNA, α,,, và, nhưng ba loại chính là α, và e. Polymerase 8 có liên quan đến sự sao chép của sợi dẫn đầu. Polymerase có thể giúp tổng hợp các chuỗi trễ cùng với các vai trò khác. Polymerase α là enzyme lớn nhất và chính của sự sao chép DNA. Tất cả các polymerase DNA có một cấu hình của bàn tay kẹp với ngón tay cái ở một bên, ngón tay ở bên kia và lòng bàn tay giống như vị trí xúc tác lõm để kết hợp các cặp mẫu và cơ sở.

5. Ghép nối cơ sở:

Hai chuỗi DNA tách biệt trong chức năng nhân bản sao chép làm mẫu. Các triphosphate deoxyribonucleoside nằm đối diện với các bazơ nitơ của các mẫu DNA tiếp xúc - deTTP đối diện A, deCTP đối diện G, deATP đối diện T và deGTP đối diện C.

Tấn công nucleophin tách một pyrophosphate (PPi) khỏi triphosphate. Liên kết Phosphodiester được thiết lập. Thủy phân pyrophosphate bằng enzyme pyrophosphatase giải phóng năng lượng. Deoxyribouncleoside triphosphate → Deoxyribouncleoside monophosphate + PPi

Năng lượng được sử dụng trong việc thiết lập liên kết hydro giữa các nucleotide tự do và cơ sở nitơ của các mẫu.

6. Hình thành chuỗi:

Nó đòi hỏi DNA polymerase III (Kornberg, 1956) ở sinh vật nhân sơ và polymerase δ / ở sinh vật nhân chuẩn. DNA polymerase III là một enzyme phức tạp có bảy tiểu đơn vị (a,, ƍ, ƴ, €, θ, ). Với sự hiện diện của Mg ²⁺, ATP (GTP), TPP và DNA polymerase III, các nucleotide liền kề được tìm thấy gắn vào các bazơ nitơ của mỗi chuỗi DNA mẫu tạo liên kết phosphodiester và được liên kết để tạo thành chuỗi DNA sao chép.

Khi quá trình sao chép diễn ra, các khu vực mới của DNA cha mẹ sẽ tách ra và tách ra để quá trình sao chép diễn ra nhanh chóng từ nơi xuất phát sang đầu kia. RNA primer được loại bỏ và khoảng trống chứa đầy nucleotide bổ sung bằng DNA polymerase I. Do mở chuỗi liên tiếp chuỗi kép DNA và sao chép của nó để tạo thành hai chuỗi, sao chép DNA còn được gọi là sao chép dây kéo.

Tuy nhiên, DNA-polymerase có thể trùng hợp các nucleotide chỉ theo hướng 5 '→ 3 on trên 3 ′ -> 5 ′ vì nó thêm chúng ở đầu 3. Vì hai chuỗi DNA chạy theo hướng phản song song, hai mẫu cung cấp các đầu khác nhau để sao chép. Sao chép qua hai mẫu do đó tiến hành theo hướng ngược nhau. Một sợi có cực tính У -> 5 ′ tạo thành chuỗi bổ sung của nó liên tục vì 3'end của chuỗi sau luôn mở để kéo dài.

Nó được gọi là sợi hàng đầu. Sao chép không liên tục trên mẫu khác có cực 5 ′ → 3 vì chỉ có thể tạo một đoạn DNA ngắn theo hướng 5 ′ → 3 do tiếp xúc với một đoạn mẫu nhỏ tại một thời điểm. Các đoạn ngắn của DNA được sao chép được gọi là các đoạn Okazaki (= các đoạn Okasaki; Reiji Okazaki, 1968). Mỗi người trong số họ có 1000- 2000 bp ở sinh vật nhân sơ và 100-200 bp ở sinh vật nhân chuẩn.

Một mồi RNA cũng được yêu cầu mỗi khi một đoạn Okazaki mới được xây dựng. Sau khi thay thế mồi RNA bằng deoxyribonucleotide và trùng hợp chúng, các đoạn Okazaki được nối với nhau bằng enzyme, DNA ligase (Khorana, 1967). Chuỗi DNA được tạo thành từ các đoạn Okazaki được gọi là chuỗi trễ.

Khi một chuỗi phát triển liên tục trong khi các chuỗi khác được hình thành không liên tục, sự sao chép DNA là không liên tục. Vì sao chép tiến hành hai chiều từ nguồn gốc của sao chép hoặc ori, một chuỗi cha mẹ sẽ tạo thành một chuỗi dẫn ở một bên và tụt lại ở phía bên kia. Điều ngược lại xảy ra trên các sợi cha mẹ của phía bên kia. Điều này giúp hoàn thành việc nhân rộng đồng thời trong toàn bộ bản sao.

7. Đọc bằng chứng và sửa chữa DNA:

Một cơ sở sai đôi khi được giới thiệu trong quá trình sao chép. Tần suất là một phần mười ngàn. DNA polymerase III có thể cảm nhận như vậy. Nó quay trở lại, loại bỏ cơ sở sai, cho phép bổ sung cơ sở thích hợp và sau đó tiến về phía trước. Tuy nhiên, ngay cả DNA polymerase III cũng không thể phân biệt uracil với thymine do đó nó thường được kết hợp thay cho thymine. Sự không phù hợp như vậy được sửa chữa bằng một số enzyme.

Có một cơ chế sửa chữa riêng biệt cho bất kỳ thiệt hại nào gây ra cho DNA do đột biến, phơi nhiễm UV hoặc không khớp mà thoát khỏi cơ chế đọc bằng chứng. Một nick hoặc phá vỡ được gây ra bởi một endonuclease gần khu vực sửa chữa. DNA polymerase I (Komberg, 1969) loại bỏ các nucleotide không khớp hoặc sai nếu có và tổng hợp một sự thay thế chính xác bằng cách sử dụng chuỗi nguyên vẹn làm mẫu. Đoạn mới được hình thành được niêm phong bởi DNA ligase.