Thử nghiệm Ortho-Nitrophenyl Galactoside trên vi khuẩn để tìm khả năng thủy phân Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside

Đọc bài viết này để tìm hiểu về hiệu suất của Ortho-Nitrophenyl Galactoside trên vi khuẩn để tìm khả năng thủy phân Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside!

Nguyên tắc:

Một số vi khuẩn có khả năng lên men đường sữa. Chúng được gọi là "vi khuẩn lên men đường sữa" hoặc "vi khuẩn đường sữa".

Những loại khác, không thể lên men đường sữa được gọi là vi khuẩn không lên men đường sữa hoặc 'không có đường sữa'.

Vi khuẩn lên men đường sữa có thể tạo ra hai loại enzyme là 'permease' và '-galactosidase', có liên quan đến quá trình lên men đường sữa. Permease giúp sự xâm nhập của đường sữa vào các tế bào vi khuẩn, trong khi β-galactosidase thủy phân đường sữa thành glucose và galactose, -galactosidase là một enzyme cảm ứng nội bào, sản xuất được tạo ra bởi sự hiện diện của tế bào vi khuẩn.

Mặc dù vi khuẩn lên men đường sữa có thể tạo ra cả permease cũng như-galactosidase, nhưng vi khuẩn không lên men đường sữa không thể tạo ra permease, nhưng có thể hoặc không thể sản xuất-galactosidase. Thử nghiệm ONPG được thực hiện để tìm ra khả năng vi khuẩn không lên men đường sữa tạo ra-galactosidase.

Đối với điều này, màng tế bào của các tế bào vi khuẩn không lên men đường sữa được hòa tan bằng cách thêm toluene, để giải phóng tất cả các enzyme nội bào bao gồm P-galactosidase, nếu có. Enzym, β-galactosidase, thủy phân chất nền ortho- nitrophenyl--D-galctoside (ONPG) thành ortho-nitrophenol, có màu vàng.

Trong thử nghiệm ortho-nitrophenyl galactoside (thử nghiệm ONPG), vi khuẩn thử nghiệm được phát triển trên môi trường thạch ba đường sắt (TSI agar), có chứa đường sữa. Nếu vi khuẩn không được lên men đường sữa, như được chỉ định bởi mông đỏ và xiên đỏ, một huyền phù dày của vi khuẩn được tạo ra trong nước muối, được thêm vào toluene sau đó là dung dịch ONPG. Nếu vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme P-galactosidase, màu của huyền phù vi khuẩn chuyển sang màu vàng.

Vật liệu thiết yếu:

Các ống nghiệm, bình nón, phích cắm bông, vòng cấy, kim tiêm, nồi hấp, lò đốt bunsen, buồng chảy tầng, bình vứt, máy ấp trứng, môi trường thạch TSI, toluene, o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG) hoặc nuôi cấy thuần chủng vi khuẩn.

Thủ tục:

1. Các thành phần của môi trường thạch TSI (chứa 3 loại đường và sắt là thành phần chính) hoặc bột làm sẵn cần 100 ml môi trường được cân và hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml lắc và xoáy (Hình 7.16).

2. Độ pH của nó được xác định bằng cách sử dụng giấy pH hoặc máy đo pH và được điều chỉnh thành 7.4 bằng HCI 0, 1N nếu nhiều hơn hoặc sử dụng NaOH 0, 1N nếu ít hơn.

3. Bình được đun nóng để hòa tan hoàn toàn agar trong môi trường.

4. Trước khi nó đông cứng, môi trường trong điều kiện nóng chảy ấm được phân phối vào 5 ống nghiệm (mỗi ống khoảng 20 ml).

5. Các ống nghiệm được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

6. Chúng được khử trùng ở 121 ° C (áp suất 15 psi) trong 15 phút trong nồi hấp.

7. Sau khi khử trùng, chúng được lấy ra khỏi nồi hấp và giữ ở vị trí xiên để làm mát và hóa rắn môi trường, để có được môi trường thạch TSI.

8. Vi khuẩn thử nghiệm được tiêm vô trùng, tốt nhất là trong buồng chảy tầng, vào các khe bằng cách đâm vào mông và vệt trên bề mặt của xiên với sự trợ giúp của kim khử trùng ngọn lửa. Kim được khử trùng sau mỗi lần tiêm.

9. Các xiên cấy được ủ ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm.

10. Nếu vi khuẩn là chất lên men đường sữa, nó không được chọn để thử nghiệm ONPG. Nếu vi khuẩn là lactose- không lên men, như được chỉ định bởi mông đỏ và xiên đỏ, nó được chọn để thử nghiệm ONPG.

11. Để một ống nghiệm chứa 0, 25 ml nước muối, môi trường nuôi cấy vi khuẩn dày được đặt bằng vòng khử trùng bằng ngọn lửa, để tạo ra huyền phù dày của vi khuẩn.

12. Một giọt toluene được thêm vào, trộn và ủ trong 5 phút ở 37 ° C.

13. Dung dịch O-nitrophenyl galactoside (dung dịch ONPG) được thêm vào và ủ ở 37 ° C trong 30 phút. Sau đó, sự thay đổi màu sắc được quan sát. Một lần nữa sự thay đổi màu sắc được quan sát sau 24 giờ.