Thử nghiệm Oxidase trên vi khuẩn để tìm ra khả năng oxy hóa giảm Cytochrom C của chúng

Đọc bài viết này để tìm hiểu về xét nghiệm oxyase trên Vi khuẩn để tìm hiểu khả năng oxy hóa giảm Cytochrom C của chúng:

Nguyên tắc:

Một số vi khuẩn có khả năng oxy hóa 'cytochrom C' hiện diện trong tế bào của chúng thành 'cytochrom C' bị oxy hóa, vì chúng có thể tạo ra enzyme 'cytochrom oxidease'.

Cytochrom C bị oxy hóa tạo ra màu tím (màu tím của Wurster) với thuốc nhuộm N-tetramethyl-para-phenylenediamine (tức là thuốc thử oxy hóa).

Trong xét nghiệm oxyase, các đĩa thạch dinh dưỡng có chứa khuẩn lạc của vi khuẩn thử nghiệm được làm ngập bằng dung dịch thuốc thử oxy hóa. Nếu vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme cytochrom oxydase, màu của khuẩn lạc trên các đĩa sẽ chuyển sang màu tím. Nếu vi khuẩn không có khả năng sản xuất cytochrom oxydase, các khuẩn lạc giữ lại màu hồng ban đầu của thuốc thử oxyase.

Vật liệu thiết yếu:

Đĩa Petri, bình nón, phích cắm bông, vòng cấy bạch kim, nồi hấp, lò đốt bunsen, buồng chảy tầng, bình vứt, máy ấp trứng, dải giấy lọc Whatman, thuốc thử oxyase (N- tetramethyl-para-phenylenediamine) nuôi cấy thuần chủng vi khuẩn.

Thủ tục:

(a) Phương pháp tấm:

1. Hai đĩa petri được làm sạch, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su (Hình 7.19). Các bước này cũng như khử trùng các đĩa petri ở bước 6 được bỏ qua, nếu các đĩa petri tiệt trùng bằng lò được sử dụng trực tiếp.

2. Các thành phần của môi trường thạch dinh dưỡng hoặc bột làm sẵn cần cho 100 ml môi trường được cân và hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml bằng cách lắc và xoay.

3. Độ pH của nó được xác định bằng cách sử dụng giấy pH hoặc máy đo pH và được điều chỉnh thành 7, 0 bằng HCI 0, 1N nếu nhiều hơn hoặc sử dụng NaOH 0, 1N nếu ít hơn.

4. Bình được đun nóng để hòa tan hoàn toàn agar trong môi trường.

5. Bình được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

6. Hai đĩa petri và bình nón chứa môi trường thạch dinh dưỡng được khử trùng ở 121 ° C (áp suất 15 psi) trong 15 phút trong nồi hấp.

7. Sau khi khử trùng, chúng được lấy ra khỏi nồi hấp và để nguội trong một thời gian, mà không cho phép môi trường hóa rắn. Làm mát môi trường ngăn chặn sự ngưng tụ và tích tụ các giọt nước bên trong các tấm. Nếu môi trường đã được chuẩn bị và hóa rắn trong quá trình bảo quản, nó phải được hóa lỏng bằng cách đun nóng cẩn thận cho đến khi nó tan chảy hoàn toàn.

8. Để chuẩn bị các đĩa thạch dinh dưỡng, trước khi môi trường thạch dinh dưỡng tiệt trùng nguội đi và đông cứng lại, trong điều kiện nóng chảy, nó được đổ vô trùng, tốt nhất là trong buồng chảy tầng, vào hai đĩa petri đã khử trùng (khoảng 20 ml mỗi lần) môi trường nóng chảy bao phủ hoàn toàn dưới cùng của đĩa petri.

Sau đó, các tấm được phủ bằng nắp đậy của chúng và để nguội, để làm cứng môi trường trong đó. Hơi nước có thể ngưng tụ trên bề mặt bên trong của các tấm và nắp được bốc hơi bằng cách giữ các tấm và nắp ở vị trí đảo ngược trong tủ ấm ở 37 ° C trong khoảng 1 giờ.

9. Mỗi tấm được đánh dấu ở phía dưới thành bốn phần tư.

10. Cấy vi khuẩn tại chỗ của vi khuẩn thử nghiệm được thực hiện một cách vô trùng, tốt nhất là trong buồng chảy tầng, ở trung tâm của mỗi quý bằng cách tạo một đốm (hoặc vết nhỏ) của vi khuẩn với sự trợ giúp của vòng khử trùng ngọn lửa. Các vòng lặp được khử trùng sau mỗi lần tiêm chủng.

11. Các đĩa được cấy được ủ ở vị trí đảo ngược, từ trên xuống, ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm cho đến khi nhìn thấy các khuẩn lạc của vi khuẩn.

12. Các tấm được ngập trong thuốc thử oxy hóa.

(b) Phương pháp giấy:

1. Một dải giấy lọc Whatman, nhúng vào thuốc thử oxy hóa 1% được sấy khô và giữ trong bóng tối.

2. Trước khi sử dụng, nó được làm ẩm và một vòng của vi khuẩn thử nghiệm được đặt trên đó như một điểm với sự trợ giúp của vòng dây bạch kim. Vòng lặp niken có thể oxy hóa thuốc thử. Do đó, vòng bạch kim phải được sử dụng.

3. Điểm được quan sát sau 10 giây.