Những tiến bộ gần đây trong chẩn đoán sốt rét

Những tiến bộ gần đây trong chẩn đoán bệnh sốt rét - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Giới thiệu:

Ở Ấn Độ, sốt rét là một vấn đề sức khỏe lớn; đã có những vụ dịch thường xuyên ở Rajasthan và các quốc gia Đông Bắc. Ở Rajasthan, tỷ lệ mắc P. falciparum đang gia tăng. Ở Delhi P. vivax là loài phổ biến nhất, nhưng P. falciparum cũng gặp phải. Sốt rét, một vấn đề trên toàn thế giới, giết chết từ 1, 5 đến 2, 7 triệu người mỗi năm. Nói cách khác, nó giết chết một người (thường là một đứa trẻ <5 tuổi) cứ sau 12 giây. Ngoài ra, 300-500 triệu người bị nhiễm căn bệnh này mỗi năm.

Để kiểm soát bệnh chẩn đoán nhanh và chính xác là quan trọng nhất. Chẩn đoán sốt rét thường chỉ được thực hiện dựa trên các triệu chứng lâm sàng mặc dù độ chính xác của nó cao nhất là 50%. Các kỹ thuật chẩn đoán mới hơn, tiên tiến hơn hiện đã có. Các nghiên cứu được giới thiệu gần đây dựa trên xét nghiệm miễn dịch rất nhanh (<10 phút / lần kiểm tra) và ít nhất là nhạy như kính hiển vi truyền thống.

Kính hiển vi ánh sáng: Vết máu dày và mỏng:

Các thủ tục trong phòng thí nghiệm được chấp nhận theo truyền thống để chẩn đoán bệnh sốt rét đã được kiểm tra bằng kính hiển vi Giemsa - hoặc xét nghiệm máu - nhuộm vết máu. Lý tưởng nhất là lấy máu bằng ngón tay; tuy nhiên, máu thu được bằng cách lấy máu tĩnh mạch và chống đông máu (EDTA hoặc heparin) có thể được chấp nhận nếu được kiểm tra ngay lập tức. Cả hai vết bẩn dày và mỏng nên được thực hiện. Vết bẩn dày, tập trung các tế bào màu đỏ 20 - 30 lần trên một bề mặt nhỏ, làm tăng độ nhạy của kỹ thuật và tốt hơn nhiều so với phết mỏng. Smear mỏng tuy nhiên, là cụ thể hơn.

Đây là tiêu chuẩn vàng được chấp nhận để chẩn đoán nhưng cần nhiều lao động và việc giải thích kết quả đòi hỏi phải có chuyên môn đáng kể, đặc biệt là với ký sinh trùng thấp. Ngoài ra, ký sinh trùng P falciparum thường bị cô lập khỏi máu ngoại vi có thể dễ dàng bị bỏ qua.

Định lượng Ký sinh trùng bằng cách kiểm tra vết máu:

Có nhiều phương pháp để định lượng ký sinh trùng sốt rét trong vết bẩn dày. Mức độ ký sinh trùng cũng có thể được định lượng bằng cách kiểm tra phết máu mỏng. Một nhược điểm lớn của vết bẩn dày là nó thường đòi hỏi một mức độ chuyên môn nhất định có thể không có sẵn.

Về mặt lý thuyết, người kiểm tra nên đếm các trường có vệt dày chứa từ 20 bạch cầu / hpf trở lên. Trong thực tế, các trường chứa từ 20 bạch cầu trở lên quá dày để đếm, trong khi các trường dễ đọc nhất là các trường chỉ chứa năm hoặc sáu bạch cầu / hpf.

Trước khi nhuộm, người kiểm tra phải có thể đọc được bản in thông qua một vệt máu dày được chuẩn bị tốt. Kiểm tra vết bẩn mỏng chỉ bằng 1/10 so với kiểm tra vết bẩn dày. Do đó, mặc dù việc kiểm tra phết máu có thể được chấp nhận là "tiêu chuẩn vàng", nhưng thực tế không có phương pháp duy nhất, tiêu chuẩn nào được sử dụng bởi tất cả các nhà điều tra, để định lượng ký sinh trùng bằng cách đếm ký sinh trùng trong vết bẩn dày.

Ngoài ra, dưới đội ngũ nhân viên được đào tạo, việc thiếu kính hiển vi sẽ hạn chế tính hữu ích của xét nghiệm phết máu ở nhiều khu vực lưu hành. Nhận thấy những hạn chế này, các kỹ thuật thay thế để chẩn đoán sốt rét đã được phát triển.

Kính hiển vi huỳnh quang:

Ba kỹ thuật huỳnh quang giữ lời hứa chẩn đoán sốt rét.

Đó là:

(i) Phương pháp đệm định lượng (OBC) có sẵn như là một bộ thương mại

(ii) Quá trình Kawamoto Acridine Orange (AO) và

(iii) Thủ tục Benzothiocarboxypurine (BCP).

Ba kỹ thuật này nhanh chóng và dễ thực hiện; khi có hơn 100 ký sinh trùng / PhaL, chúng chứng minh độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với những con đạt được bằng cách kiểm tra phết dày.

Cả hai phương pháp OBC và Kawamoto đều sử dụng Acridine Orange (AO) làm fluorochrom để nhuộm axit nucleic của ký sinh trùng sốt rét trong một mẫu. BCP cũng là một fluorochrom, nhuộm axit nucleic. AO là không đặc hiệu và nhuộm axit nucleic từ tất cả các loại tế bào.

Do đó, người kiểm tra cần học cách phân biệt ký sinh trùng nhuộm huỳnh quang với các tế bào khác và các mảnh vụn của tế bào. Độ nhạy của nhuộm AO với mức độ ký sinh trùng dưới 100 ký sinh trùng / PhaL là 41, 7-93%.

Độ đặc hiệu của nhuộm AP đối với P. vivax và P. falciparum lần lượt là 52 và 93%. Phương pháp BCP có độ nhạy và độ đặc hiệu hơn 90%. Hạn chế quan trọng của các phương pháp dựa trên AO và BCP là chúng không có khả năng phân biệt giữa các loài Plasmodium. AO là nguy hiểm và yêu cầu xử lý đặc biệt.

OBC và BCP đòi hỏi kỹ thuật cao hơn Kawamoto. Phương pháp Kawamoto và AO đòi hỏi thiết bị và vật tư đặc biệt và đắt tiền hơn. Giá của kính hiển vi huỳnh quang có thể là một yếu tố hạn chế đối với các phòng thí nghiệm quan tâm đến việc sử dụng các phương pháp này.

Phát hiện các chuỗi axit nucleic cụ thể:

Phát hiện trình tự axit nucleic đặc trưng cho ký sinh trùng Plasmodium có thể hữu ích. Trong các kỹ thuật dựa trên PCR, trình tự đích khuếch đại được phát hiện bằng các đầu dò bên trong hoặc được phân tích bằng điện di trên gel. Ưu điểm chính của việc sử dụng kỹ thuật dựa trên PCR là khả năng phát hiện 'ký sinh trùng thấp. Nhiễm trùng ký sinh trùng sống có thể được phát hiện với độ đặc hiệu 100 phần trăm.

Tuy nhiên, các kỹ thuật như vậy rất tốn kém và tốn nhiều công sức, đòi hỏi chuyên môn kỹ thuật sâu rộng, bao gồm nhiều bước và không thể được sử dụng để phân biệt giữa các sinh vật sống và không sống được.

Các chất ức chế PCR hiện diện tự nhiên trong các mẫu máu có thể dẫn đến một số lượng đáng kể kết quả âm tính giả. Kết quả dương tính giả, vì ô nhiễm chuyển giao, cũng đã được ghi nhận.

Các kỹ thuật dựa trên PCR đã được sử dụng để sàng lọc các nhà tài trợ ở khu vực có sốt rét lưu hành. Độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp dựa trên PCR, được ước tính bằng cách sử dụng xét nghiệm phết máu là 'tiêu chuẩn vàng', mỗi loại 90% trở lên.

Ngoài ra, những tiến bộ hơn nữa trong công nghệ PCR có thể sớm cho phép các ký sinh trùng khả thi được phân biệt với không thể sống được. Hiện tại tính hữu dụng của công nghệ này bị hạn chế bởi nhu cầu về thiết bị phòng thí nghiệm chuyên dụng, đắt tiền, nhân viên được đào tạo về công nghệ di truyền và cơ sở 'phòng sạch' và chi phí sử dụng enzyme và mồi cao.

Phát hiện kháng nguyên:

Các xét nghiệm phát hiện kháng thể đối với bệnh sốt rét bị hạn chế về độ nhạy và khả năng phân biệt hoạt động với các bệnh nhiễm trùng trước đó. Các xét nghiệm bắt giữ kháng nguyên thế hệ mới có khả năng phát hiện ít ký sinh trùng hơn và cho kết quả nhanh chóng (10-15 phút). Chúng là các bộ dụng cụ thương mại, bao gồm tất cả các thuốc thử cần thiết và không yêu cầu đào tạo hoặc thiết bị mở rộng.

Có hai loại kháng nguyên ký sinh trùng được sử dụng trong các xét nghiệm chẩn đoán mới, nhanh chóng, protein giàu histidine-2 (HRP-2), chỉ được sản xuất bởi P. falciparum và kháng nguyên ký sinh lactate-dehydrogenase (pLDH), được sản xuất bởi cả bốn loài plasmodium lây nhiễm cho con người. Cả hai kháng nguyên được tiết vào máu bởi tất cả các giai đoạn vô tính của ký sinh trùng; kháng nguyên pLDH cũng được tạo ra bởi các giao tử.

Các xét nghiệm thu nhận kháng nguyên mới nhất được thực hiện nhanh chóng và đơn giản và có giới hạn phát hiện tương đương với các kính hiển vi chất lượng cao (ví dụ 100- 200 ký sinh trùng / mậtL). Khi có hơn 60 - 100 ký sinh trùng / mậtL, HRP- 2 xét nghiệm dựa trên có độ nhạy cao (> 90%) và (> 90%), khi so sánh với kính hiển vi soi dày.

Hiện tại, hai xét nghiệm như vậy đã có sẵn trên thị trường, thử nghiệm ParaSight F và Thử nghiệm Sốt rét (CNTT miễn dịch). Cả hai xét nghiệm đều được thực hiện trên các mẫu chích ngón tay và chỉ phát hiện sốt rét do P. falciparum.

Chúng dựa trên các kháng thể đơn dòng với HRP-2, được cố định trên các dải nitrocellulose, để tạo ra các que thử hoặc các xét nghiệm bằng bìa cứng (Kiểm tra Pf thử nghiệm). Trong mỗi xét nghiệm, một kết quả dương tính được biểu thị bằng sự xuất hiện của một vạch đỏ trên dải thử nghiệm, trong đó các kháng thể đơn dòng là bất động.

Cả hai bài kiểm tra cũng có một kiểm soát tích hợp; một dòng điều khiển phải xuất hiện để kiểm tra được coi là hợp lệ. Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm ParaSight F lần lượt là 88 và 97%, tương đương với PCR.

Mặc dù các xét nghiệm huyết thanh học dựa trên HRP-2 đã cho phép chẩn đoán nhanh bệnh sốt rét falciparum, nhưng chúng có tính hữu dụng hạn chế. Vì HRP-2 chỉ có ở P. falciparum, các xét nghiệm dựa trên việc phát hiện HRP-2 đều âm tính với nhiễm trùng do vivax, ovale hoặc sốt rét.

Do đó, nhiều trường hợp sốt rét không do falciparum sẽ được chẩn đoán nhầm là sốt rét âm tính. Một hạn chế khác của các xét nghiệm dựa trên HRP-2 là HRP-2 tồn tại trong máu rất lâu sau khi các triệu chứng lâm sàng biến mất và ký sinh trùng rõ ràng đã bị loại bỏ khỏi vật chủ.

Trên thực tế, HRP-2 đã được phát hiện trong các xác ướp. Do đó, xét nghiệm tìm kháng nguyên này có thể không hữu ích để sàng lọc những người bản địa đến các khu vực lưu hành, những người có thể bị ký sinh trùng ở mức độ thấp, dai dẳng. Lý do có thể cho sự tồn tại của kháng nguyên HRP-2 vẫn chưa được hiểu rõ; nó có thể phản ánh sự hiện diện của ký sinh trùng tiềm ẩn, khả thi (có thể là kết quả của thất bại điều trị) hoặc phức hợp kháng nguyên-kháng thể hòa tan.

Sự kiên trì cũng có thể phụ thuộc vào loại trị liệu chống sốt rét được thiết lập. Tín hiệu HRP-2 có thể tồn tại trong 19 ngày sau khi điều trị bằng quinine và doxycycline rõ ràng có hiệu quả. Ngoài ra, kháng nguyên HRP-2 kéo dài đã được quan sát trong và sau khi điều trị bằng artemether.

Các hạn chế khác liên quan cụ thể đến các khía cạnh kỹ thuật của hệ thống HRP-2. Ví dụ, IgG đơn dòng được sử dụng trong hệ thống ParaSight F có thể phản ứng chéo với yếu tố thấp khớp và gây ra phản ứng dương tính giả.

Thử nghiệm CNTT Pf sử dụng IgM đơn dòng, không phản ứng chéo và không có báo cáo về phản ứng dương tính giả xảy ra với xét nghiệm này vì yếu tố thấp khớp. Tuy nhiên, thử nghiệm CNTT Pf yêu cầu lưu trữ ở 4 ° C, điều này hạn chế tính hữu dụng của nó trong các tình huống tại hiện trường.

Xét nghiệm huyết thanh học dựa trên pLDH:

Các xét nghiệm huyết thanh nhanh mới nhất để chẩn đoán sốt rét dựa trên việc phát hiện pLDH. Giống như các xét nghiệm dựa trên HRP- 2, các xét nghiệm này rất nhạy cảm, cụ thể và dễ thực hiện, với kết quả có thể đạt được trong vòng chưa đầy 15 phút.

Các xét nghiệm dựa trên pLDH cũng có thể phân biệt giữa P. falciparum và các loài Plasmodium khác và, vì pLDH chỉ được tạo ra bởi ký sinh trùng khả thi, chúng cũng hữu ích trong việc theo dõi liệu pháp chống sốt rét. pLDH từ P. falciparum được phân biệt với LDH chủ (h-LDH) với 3-acetylpyridine adenine dinucleotide (APAD), một chất tương tự của Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD).

Các xét nghiệm dựa trên pLDH có sẵn ở hai dạng, một dạng bán định lượng, khô, nhúng (OptiMAL); và một xét nghiệm bắt giữ định lượng, miễn dịch enzyme. Xét nghiệm OptiMAL sử dụng hai kháng thể đơn dòng, một loại đặc hiệu cho P. falciparum và loại còn lại nhận ra cả 4 Plasmodia.

Mẫu máu được thử nghiệm (10 LờiL của chích ngón tay, máu toàn phần hoặc tan máu đông lạnh) được trộn với 3o cáchL, dung dịch đệm chứa kháng thể đơn dòng liên hợp. Hỗn hợp này được phép ngâm vào OptiMAL, que thăm.

Sau 3 phút, 100 bộ đệm xóa 100L được thêm vào. Nếu P. falciparum có trong mẫu máu, ba dòng (bao gồm một dòng, ở đầu mỗi que, đại diện cho sự kiểm soát tích cực) phát triển trên các que thăm.

Hai dòng chỉ P. vivax, P. malariae hoặc đôi khi, P. ovale. Một dải OptiMAL-2 mới được định dạng có ba dòng thử nghiệm và một dòng kiểm soát dương tính, cho phép xác định tất cả bốn loài Plasmodium.

Mỗi thử nghiệm chỉ được coi là ualid nếu dòng điều khiển phát triển. Các kháng thể đơn dòng được sử dụng trong xét nghiệm OptiMAL đã được kiểm tra toàn diện về phản ứng chéo với LDH từ leishmania, Babia và vi khuẩn gây bệnh hoặc nấm và không tìm thấy bằng chứng nào về phản ứng chéo như vậy.

HRP-2 đã được tìm thấy để tồn tại tốt sau khi đã loại bỏ ký sinh trùng ngoại biên. Mặc dù nồng độ pLDH theo sát ký sinh trùng ngoại biên và giảm xuống các giá trị không thể phát hiện 3-5 ngày sau khi điều trị bằng quinine và doxycycline, nồng độ kháng nguyên HRP-2 chỉ giảm sau 19 ngày, sau khi bệnh nhân không có triệu chứng và rõ ràng là không có ký sinh trùng.

Do đó, xét nghiệm OptiMAL phải là một công cụ có giá trị trong việc theo dõi liệu pháp chống sốt rét. Giải phóng ký sinh trùng và thanh thải pLDH xuất hiện song song với nhau.

Xét nghiệm OptiMAL, rất linh hoạt. OptiMAL, xét nghiệm có độ nhạy tương ứng là 94 - 88% và độ đặc hiệu tương ứng là 100 và 99% đối với P. vivax và P. falciparum, khi so sánh với phết máu.

Thử nghiệm này có thể được sử dụng như một công cụ dịch tễ học vì ở những khu vực có nhiều hơn một loài Plasmodium đang lưu hành, nó có thể được sử dụng để xác định các loài Plasmodium lây nhiễm bệnh nhân ở mỗi làng một cách nhanh chóng .

Kết luận:

Trong vài năm qua, những nỗ lực thay thế cách đọc vết máu truyền thống và tẻ nhạt (một phương pháp được phát triển gần 100 năm trước) đã dẫn đến các kỹ thuật phát hiện ký sinh trùng sốt rét mang lại độ nhạy tương đương hoặc tốt hơn kính hiển vi.

Mặc dù các phương pháp dựa trên PCR được cho là nhạy cảm nhất, nhưng chúng rất tốn kém và cần thiết bị và đào tạo chuyên dụng đến mức chúng khó có thể được sử dụng để chẩn đoán thông thường ở hầu hết các nước đang phát triển.

Chúng đặc biệt hữu ích cho các nghiên cứu về sự khác biệt về chủng, đột biến và gen liên quan đến kháng thuốc ở ký sinh trùng và cho thấy mức độ liên quan giữa các chủng liên quan đến các đợt dịch sốt rét khác nhau. Các chẩn đoán sốt rét mới, hứa hẹn nhất là các xét nghiệm que thử huyết thanh.

Các thử nghiệm này, bao gồm ParaSight F, ICT Pf Test và OptiMAL, sử dụng đơn giản, dễ hiểu và tạo ra kết quả sau 15 phút hoặc ít hơn. Các xét nghiệm này gần như nhạy cảm như kiểm tra bằng kính hiển vi của phết máu, nhưng không yêu cầu nhân viên có tay nghề cao để thực hiện hoặc giải thích kết quả.

Xét nghiệm OptiMAL có thêm ưu điểm là có thể phát hiện cả bốn loài Plaspiodium và tuân theo hiệu quả của việc điều trị bằng thuốc, vì nó đo một loại enzyme chỉ được tạo ra bởi ký sinh trùng sống.

Mặc dù các bài kiểm tra nhúng có hai hạn chế rõ ràng, nhưng không nên ngăn các bài kiểm tra này nhận được sự chấp nhận rộng rãi. Hạn chế đầu tiên là sự nhạy cảm. Ba xét nghiệm hiện được bán trên thị trường có ngưỡng độ nhạy là 50 - 100 ký sinh trùng / Pha1. Độ nhạy đối với các mẫu có <50 ký sinh trùng / mậtL luôn ở mức 50% -70%.

Mức độ nhạy cảm này có thể không phải là vấn đề đối với những người sống lâu dài ở các vùng lưu hành, những người thường không được điều trị trừ khi họ có hơn 500 ký sinh trùng / máu, nhưng có thể gây ra vấn đề trong chẩn đoán sốt rét ở những người là từ các khu vực không lưu hành nhưng đang sống, làm việc hoặc đi du lịch trong khu vực lưu hành.

Tuy nhiên, vì đại đa số bệnh nhân sốt rét có mức độ ký sinh trùng cao hơn 50 ký sinh trùng / KhănL, một số bệnh nhân sẽ bị chẩn đoán sai nếu xét nghiệm que thử được sử dụng thường xuyên. Hạn chế thứ hai của các xét nghiệm như vậy, ít nhất là hiện tại, là chi phí của chúng.

Tổ chức Y tế Thế giới cho rằng, đối với những người ở khu vực lưu hành để tận dụng lợi thế của họ, các xét nghiệm chẩn đoán bệnh sốt rét nên có giá thấp hơn 0, 40 USD / mẫu. Trừ khi các thử nghiệm nhúng được sản xuất với số lượng lớn, mức giá này là không thể đạt được và không thực tế cho các nhà sản xuất để đáp ứng.

Các chi phí hiện tại của các thử nghiệm que thăm phụ thuộc vào vị trí của người mua và khối lượng đặt hàng. Ví dụ: chi phí của Bài kiểm tra CNTT Pf dao động từ US $ 1, 30 / bài kiểm tra ở các nước đang phát triển. Các thử nghiệm Para 0Sight F được bán với giá US $ 1, 20 / thử nghiệm. Dải optiMAL hiện được bán với giá US $ 3, 00 / thử nghiệm.