Vi khuẩn có mặt trong một mẫu bằng phương pháp mạ Agar pha loãng nối tiếp hoặc phương pháp tổng số tấm (TPC)
Tổng số tấm (TPC):
Để liệt kê vi khuẩn có mặt trong một mẫu bằng phương pháp mạ agar pha loãng nối tiếp hoặc phương pháp tổng số tấm (TPC).
Mục đích:
Mức độ hoạt động của vi khuẩn trong một mẫu nhất định trong một tập hợp các điều kiện xác định chủ yếu phụ thuộc vào tổng số vi khuẩn có trong đó không phân biệt loài của chúng.
Do đó, rất thường xuyên phải tìm ra tổng số vi khuẩn có trong các mẫu thực phẩm, nước, đất, không khí và mô trong quá trình phân tích vi sinh. Tổng số vi khuẩn này bao gồm cả vi khuẩn sống và vi khuẩn chết. ' Vi khuẩn chết không thể phát triển và sinh sản.
Nó chỉ là vi khuẩn sống (vi khuẩn khả thi), có thể phát triển và nhân lên dẫn đến hoạt động của vi khuẩn cụ thể. Do đó, rất thường được yêu cầu liệt kê các tế bào vi khuẩn khả thi trong các mẫu khác nhau. Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp liệt kê như đếm vi mô trực tiếp, đếm tế bào điện tử, phương pháp hóa học và phương pháp đo quang phổ đều đếm cả tế bào sống cũng như tế bào chết.
Những phương pháp này không thể phân biệt giữa tế bào sống và tế bào chết. Do đó, phương pháp mạ pha loãng nối tiếp, trong đó chỉ liệt kê các tế bào vi khuẩn khả thi, là phương pháp được sử dụng phổ biến để đếm các tế bào sống sót trong các mẫu khác nhau.
Nguyên tắc:
Một khối lượng nhất định của mẫu rắn được đồng nhất hóa vô trùng trong chín thể tích nước muối vô trùng để có được một hệ thống treo vi khuẩn đồng nhất. Mẫu chất lỏng được sử dụng trực tiếp như là huyền phù đồng nhất của vi khuẩn. Các huyền phù của vi khuẩn thu được được pha loãng huyết thanh (10 lần, 100 lần, 1000 lần, v.v.). Ở đây 10 -1, 10 -2, 10 -3 v.v ... được gọi là pha loãng.
Các đối ứng của chúng (10 1, 10 2, 10 3, v.v.) được gọi là các yếu tố pha loãng. Một thể tích nhất định của huyền phù vi khuẩn từ mỗi độ pha loãng được cấy vào các đĩa thạch và lây lan đúng cách, để không gian các tế bào vi khuẩn riêng biệt tách ra và cách ly chúng với nhau.
Việc tiêm vi khuẩn cho phép liệt kê được thực hiện theo hai kỹ thuật như sau:
1. Kỹ thuật đổ đĩa
2. Kỹ thuật tấm trải
1. Kỹ thuật đổ đĩa:
Trong kỹ thuật này, 1 ml huyền phù vi khuẩn được thả vào đĩa petri đã khử trùng và sau đó môi trường thạch dinh dưỡng hóa lỏng được đổ lên nó. Đĩa petri được xoay nhẹ nhàng, để cho phép hỗn dịch trộn với phương tiện đồng đều. Nó được phép làm mát và hóa rắn.
2. Kỹ thuật trải tấm:
Trong kỹ thuật này, 0, 1 ml huyền phù vi khuẩn được thả vào đĩa thạch đã chuẩn bị. Sau đó, giọt huyền phù được trải đều trên đĩa thạch bằng máy rải thủy tinh tiệt trùng.
Để giảm thiểu lỗi, mỗi huyền phù pha loãng được mạ lên 2-5 tấm sao chép. Các tấm được cấy được ủ ở 37 ° C trong 24 giờ. Trong giai đoạn này, mỗi tế bào vi khuẩn riêng lẻ bị cô lập trên đĩa thạch phát triển và nhân lên nhanh chóng để tạo ra một khối tế bào vi khuẩn có thể nhìn thấy được ở tầm vĩ mô gọi là "thuộc địa". Do đó, số lượng khuẩn lạc trên đĩa đại diện cho số lượng vi khuẩn trong mẫu.
Tuy nhiên, rất thường xuyên, trong quá trình lây lan, một số tế bào có thể không được phân tách đúng cách và một số tế bào không tách rời như vậy có thể tạo ra một thuộc địa duy nhất. Hơn nữa, một số tế bào có xu hướng ở lại theo cặp, chuỗi hoặc cụm.
Ở đây, mỗi cặp, chuỗi hoặc cụm tạo ra một thuộc địa. Do đó, mỗi thuộc địa, theo nghĩa chặt chẽ, không đại diện cho một loại vi khuẩn. Đó là lý do tại sao, thay vì biểu thị số lượng vi khuẩn là 'Không. của vi khuẩn / gm hoặc ml mẫu ', nó thường được biểu thị bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gm hoặc ml (CFU / gm hoặc ml).
Tổng số tấm (TPC) trong mẫu ban đầu được tính bằng cách nhân số lượng CPU với các hệ số pha loãng tương ứng. "Quy tắc liệt kê" được tuân theo, đồng thời tính toán số lượng vi khuẩn trong mẫu ban đầu.
Vật liệu thiết yếu:
Đĩa Petri (15 nos.), Pipet 2 ml (10 nos.), Pipet 10 ml (1 no.), Ống nghiệm (10 nos.), Bình nón (500 ml và 1 lít-1 no. Mỗi), Cốc có dung tích 500 ml (2 nos.), Máy rải thủy tinh, hộp đựng bằng thép không gỉ, giấy thủ công, chỉ (hoặc dây cao su), bông không thấm nước, cồn ethyl, natri clorua (NaCl), axit clohydric 0, 1N (HCI), Natri hydroxit 0, 1N (NaOH), nước cất, agar dinh dưỡng, mẫu chất lỏng (ví dụ nước ao / nước thải), mẫu rắn (ví dụ đất / thịt cá / thịt hàu / thực phẩm chế biến), giấy pH (hoặc máy đo pH), chày và vữa (hoặc homogeniser), lò đốt bunsen, lò không khí nóng, nồi hấp, lò ấp, buồng dòng chảy tầng, quầy thuộc địa Quebec.
Thủ tục:
1. Mười pipet (trong hộp đựng bằng thép không gỉ), 15 đĩa petri và một cặp chày và cối (hoặc một cốc homogeniser) được khử trùng trong lò không khí nóng ở 180 ° C trong 3 giờ. Ngoài ra, chúng có thể được phủ bằng giấy thủ công, buộc bằng chỉ hoặc dây cao su và khử trùng trong nồi hấp cùng với phương tiện (Hình 6.6).
Số lượng đĩa petri và theo đó lượng môi trường được sử dụng được tính toán tùy thuộc vào số lượng bản sao và độ pha loãng cần thiết. Ở đây, các dụng cụ thủy tinh và phương tiện đã được thực hiện để sao chép đơn lẻ và pha loãng lên đến 10 -6 . Số lượng dụng cụ thủy tinh và lượng môi trường dùng để khử trùng nhiều hơn một chút để tránh bất kỳ lỗi ngẫu nhiên nào, bởi vì khử trùng là một quá trình dài.
2. 4, 25 g NaCl được hòa tan trong 500 ml nước cất để lấy nước muối sinh lý (0, 85%). 225 ml dung dịch muối này được đổ vào bình nón 500 ml. Miệng của nó được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su. Nó được sử dụng làm chất pha loãng đầu tiên để pha loãng mẫu rắn.
3. 9.0 ml dung dịch muối còn lại cũng được bơm vào từng ống trong số 10 ống nghiệm. Miệng của chúng được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su. Chúng được sử dụng như chất pha loãng để pha loãng nối tiếp.
4. Các thành phần của môi trường thạch dinh dưỡng hoặc bột làm sẵn cần cho 500 ml môi trường được cân và hòa tan trong 500 ml nước cất trong bình nón 1 lít bằng cách lắc và xoay.
Độ pH của nó được xác định bằng cách sử dụng giấy pH hoặc máy đo pH và điều chỉnh thành 7, 0 bằng HCN 0, 1N nếu nó nhiều hơn hoặc sử dụng NaOH 0, 1N nếu ít hơn. Bình được đun nóng để hòa tan agar trong môi trường hoàn toàn. Sau đó, nó được cắm bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.
5. Bình nón 500 ml chứa 225 ml nước muối, 10 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối mỗi bình và bình nón 1 lít chứa 500 ml môi trường thạch dinh dưỡng được khử trùng ở 121 ° C (áp suất 15 psi) trong 15 phút trong nồi hấp.
6. Sau khi khử trùng, các vật liệu tiệt trùng được lấy ra khỏi nồi hấp và để nguội một thời gian, mà không cho phép môi trường hóa rắn. Làm mát môi trường ngăn chặn sự ngưng tụ và tích tụ các giọt nước bên trong các tấm. Nếu môi trường đã được chuẩn bị và hóa rắn trong quá trình bảo quản, nó phải được hóa lỏng bằng cách đun nóng cẩn thận cho đến khi nó tan chảy hoàn toàn.
7. Để chuẩn bị các đĩa thạch, trước khi môi trường thạch dinh dưỡng tiệt trùng nguội đi và đông cứng lại, trong điều kiện nóng chảy, nó được rót vô trùng vào 6 đĩa petri đã khử trùng (mỗi đĩa khoảng 20 ml), để môi trường nóng chảy bao phủ đáy petri món ăn hoàn toàn
Sau đó, các tấm được phủ bằng nắp đậy của chúng và để nguội, để làm cứng môi trường trong đó. Hơi nước có thể ngưng tụ trên bề mặt bên trong của các tấm và nắp được bốc hơi bằng cách giữ các tấm và nắp ở vị trí đảo ngược trong tủ ấm ở 37 ° C trong khoảng 1 giờ.
8. 25 g mẫu rắn (ví dụ thịt cá / thịt hàu / thực phẩm chế biến) có trọng lượng và đồng nhất trong 225 ml nước muối tiệt trùng (chất pha loãng) vô trùng (Hình 6.7). Điều này cho độ pha loãng 10 lần (độ pha loãng = 10 -1 ). Đối với mẫu chất lỏng, 1ml mẫu được bơm vô trùng vào ống nước muối tiệt trùng 9 ml. Điều này cũng cho độ pha loãng 10 lần (độ pha loãng = 10 -1 ).
9. 1 ml dung dịch pha loãng 10 -1 được chuyển sang 9 ml nước muối tiệt trùng trong ống nghiệm khác. Điều này cho độ pha loãng 100 lần (độ pha loãng = 10 -2 ). Từ độ pha loãng 10 -2, 1 ml được thả vào đĩa petri đã khử trùng và 0, 1 ml vào đĩa thạch, từ cùng một pipet. Đối với mỗi độ pha loãng, một pipet tiệt trùng riêng được sử dụng. Sau khi sử dụng nó được nhúng vào lọ xử lý.
10. 1 ml dung dịch pha loãng 10 -2 được chuyển sang 9 ml nước muối tiệt trùng trong ống nghiệm khác. Điều này cho độ pha loãng 1000 lần (độ pha loãng = 10 -3 ). Từ độ pha loãng 10 -3, 1 ml được thả vào đĩa petri đã khử trùng và 0, 1 ml vào đĩa thạch, từ cùng một pipet. Theo cách tương tự, pha loãng được tiếp tục lên đến 10 -6 huyết thanh, mỗi lần chuyển 1ml vào đĩa petri đã khử trùng và 0, 1 ml vào đĩa thạch từ cùng một pipet.
11. Sau đó, những giọt huyền phù trên các tấm thạch được lan truyền vô trùng bằng máy rải thủy tinh tiệt trùng. Sau khi lan truyền trong mỗi đĩa, nó được khử trùng bằng ngọn lửa bằng cách nhúng vào cồn và thể hiện trên ngọn lửa. Đây là "kỹ thuật tấm trải".
12. Các đĩa petri chứa 1ml huyền phù vi khuẩn mỗi loại được lấy và agar dinh dưỡng hóa lỏng tiệt trùng được đổ vào chúng. Chúng được xoay nhẹ nhàng, để cho phép hỗn hợp hòa trộn với phương tiện đồng đều. Các tấm được làm mát cho đến khi trung bình hóa rắn. Đây là 'kỹ thuật đổ đĩa'.
13. Sau đó, các đĩa được ủ ở vị trí đảo ngược, từ trên xuống, ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm (Hình 6.7).
14. Một đĩa thạch không được tiêm được ủ dưới dạng đối chứng để đảm bảo khử trùng đúng cách như thể hiện không có sự tăng trưởng trên nó.
Quan sát:
Số lượng khuẩn lạc trên đĩa được đếm trực tiếp hoặc với sự trợ giúp của quầy thuộc địa Quebec. Từ đó, số lượng vi khuẩn hiện diện trên mỗi gram hoặc ml mẫu ban đầu được tính toán. Điều này được gọi là liệt kê.
Quy tắc liệt kê:
1. Các món ăn Petri có 30 đến 300 khuẩn lạc nên được xem xét.
2. Số lượng trung bình của các bản sao và bộ ba (R 1, R 2 R 3 )) chỉ được xem xét nếu một số lượng không nhiều hơn gấp đôi số khác. Nếu một hơn hai lần giá trị thấp hơn khác được thực hiện.
3. Đối với kỹ thuật đổ tấm, số lượng vi khuẩn là Số 10 c / gm, trong đó c = hệ số pha loãng. Đối với kỹ thuật tấm trải, số lượng vi khuẩn là số X10 c + 1 / gm, trong đó c = hệ số pha loãng. Số được chuyển đổi thành hai chữ số thập phân ở dạng (x.yz X 10 m ). Ví dụ: 288 X 10 4 được biểu thị là 2.88 X 10 6 .
4. Nếu, trong tất cả các độ pha loãng, số lượng khuẩn lạc lớn hơn 300, được tính cho độ pha loãng cao nhất và nếu trong tất cả các độ pha loãng, nó nhỏ hơn 30, hãy xem xét độ pha loãng thấp nhất. Trong cả hai trường hợp, số lượng được biểu diễn là: Ước tính Số X 10 c / gm hoặc ml cho kỹ thuật đổ tấm và Số X 10 c + 1 / gm hoặc ml ước tính cho kỹ thuật tấm trải.
5. Nếu không có thuộc địa nào được quan sát thấy trong bất kỳ độ pha loãng nào được thực hiện, nó được biểu diễn dưới dạng: Ước tính <1 x độ pha loãng thấp nhất.
6. Khi pha loãng nối tiếp diễn ra trong khoảng 10 lần, về mặt toán học, rõ ràng là không có hai pha loãng nào có thể có các khuẩn lạc trong khoảng từ 30 đến 300. Ví dụ: nếu 10 -3 có 50 khuẩn lạc thì 10 -2 nên có 500 300) và 10 -4 nên có 5 (tức là <30) khuẩn lạc.
Tuy nhiên, điều này không xảy ra trong thực tế, vì vi khuẩn không xảy ra như một giải pháp đồng nhất; thay vì xảy ra như một huyền phù trong chất pha loãng. Nếu có hai độ pha loãng có các khuẩn lạc đếm được (trong khoảng từ 30 đến 300), trước tiên hãy tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc / gm hoặc ml bằng cách sử dụng mỗi độ pha loãng.
Nếu một giá trị lớn hơn gấp đôi giá trị kia, hãy báo cáo giá trị thấp hơn. Nếu không, lấy trung bình của hai giá trị và báo cáo giá trị đó.
