Thử nghiệm cách ly Coliphage của virus (có sơ đồ)

Thử nghiệm để cô lập Coliphage của một loại virus!

Nguyên tắc:

Vi khuẩn hoặc phage (virus) lây nhiễm vi khuẩn, Escherichia coli được gọi là coliphage (coli: E. coli-, phage: khuẩn khuẩn).

Nó có thể được lấy từ nhiều nguồn tự nhiên, chẳng hạn như đất, phân và nước thải thô. Sự cô lập của nó với các nguồn này không phải là rất dễ dàng, vì nó hiện diện ở nồng độ thấp.

Do đó, đầu tiên số lượng của nó được tăng lên bằng một bước làm giàu, trong đó một nền văn hóa phong phú của vi khuẩn chủ (ví dụ E. coli) được thêm vào mẫu chứa coliphage và được ủ. Coliphage lây nhiễm E. coli và tăng số lượng rất nhiều. Nền văn hóa giàu coliphage này được ly tâm để giải quyết các hạt vật chất.

Các trầm tích bị loại bỏ và chất nổi trên bề mặt được lọc qua bộ lọc vi sinh vật để giữ lại vi khuẩn và các hạt khác, đồng thời cho phép coliphage đi qua. Dịch lọc, giàu coliphage, được sử dụng để gieo hạt huyền phù E.coli, sau đó được phép trồng như một bãi cỏ hợp lưu trên đĩa thạch.

Coliphage phát triển trong các tế bào E. coli và lyse chúng. Sự phân giải của các tế bào vi khuẩn dẫn đến sự hình thành các vùng rõ ràng trên bãi cỏ của vi khuẩn. Những vùng rõ ràng được gọi là mảng. Mỗi vùng rõ ràng được giả định là được hình thành bởi một cột.

Vật liệu thiết yếu:

Pipet, bình hình nón, đĩa petri, ống nghiệm, phích cắm bông, đầu đốt bunsen, bình vứt, máy ly tâm, thiết bị lọc màng, buồng chảy tầng, nồi hấp, lò ấp, môi trường thạch vi khuẩn, môi trường thạch mềm vi khuẩn Escherichia coli (ví dụ, E. coli B), mẫu (ví dụ, nước thải thô).

Thủ tục:

1. Năm pipet (trong hộp bằng thép không gỉ) và năm đĩa petri được khử trùng trong lò không khí nóng ở 180 ° C trong 3 giờ. Ngoài ra, chúng có thể được phủ bằng giấy thủ công, buộc bằng chỉ hoặc dây cao su và khử trùng trong nồi hấp cùng với phương tiện truyền thông (Hình 8.5).

2. Các thành phần của môi trường môi trường vi khuẩn hoặc bột làm sẵn của nó, cần cho 100 ml môi trường được cân, hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml và pH được điều chỉnh thành 7.6. Bình được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

3. Các thành phần của môi trường thạch mềm tryptone hoặc bột làm sẵn của nó, cần cho 100 ml môi trường được cân, hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml và điều chỉnh pH đến 7, 5.

4. Môi trường chất lỏng này được phân phối thành 5 ống nghiệm (mỗi ống 2 ml), cắm bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

5. Các thành phần của môi trường agarone cứng hoặc bột làm sẵn cần cho 100 ml môi trường được cân và hòa tan trong 100 ml nước cất trong bình nón 250 ml bằng cách đun nóng sau khi điều chỉnh pH đến 7, 5. Bình được cắm bằng bông, phủ giấy thủ công và buộc bằng chỉ hoặc dây cao su.

6. Bình chứa nước canh vi khuẩn, 5 ống thạch mềm tryptone, bình chứa môi trường thạch cứng tryptone và bình nón 250 ml cắm bông rỗng được khử trùng ở 121 ° C (áp suất 15 psi) trong 15 phút trong nồi hấp.

7. Môi trường thạch cứng tryptone đã khử trùng trong bình nón được đổ vào 5 đĩa petri tiệt trùng vô trùng và để nguội, để có được 5 đĩa thạch cứng tryptone.

8. Cho vào bình nón 250 ml đã được khử trùng bằng bông, 5 ml nước canh vi khuẩn tiệt trùng, 5 ml môi trường nuôi cấy E. coli B và 45 ml nước thải thô được chuyển vô trùng, tốt nhất là trong buồng chảy tầng (Hình 8.6) .

9. Bình được ủ ở 37 ° C trong 24 giờ, để cho phép chất keo trong nước thải sinh sôi nảy nở trong tế bào vi khuẩn chủ (tế bào của E. coli B).

10. Nội dung của bình được rót vào các ống ly tâm 100 ml và ly tâm với tốc độ 2500 vòng / phút trong 20 phút trong máy ly tâm để lắng các hạt. Các trầm tích bị loại bỏ.

11. Chất nổi trên mặt, giàu coliphage, được lọc qua thiết bị lọc màng. Phần dư được loại bỏ.

12. Năm ống thạch mềm tryptone đã khử trùng được lấy và đun nóng trên nồi cách thủy đến 100 ° C, để làm tan chảy thạch. Các ống được làm mát và duy trì ở 45 ° C trên nồi cách thủy.

13. Sử dụng pipet vô trùng, 1, 2, 3, 4 và 5 giọt dịch lọc không chứa vi khuẩn, giàu coliphage được chuyển vô trùng vào năm ống thạch mềm tryptone.

14. Đối với mỗi ống thạch mềm tryptone, 0, 1 ml môi trường nuôi cấy dinh dưỡng Escherichia coli B được truyền vô trùng.

15. Nội dung của năm ống thạch mềm tryptone có virut, coliphage và vi khuẩn, E. coli B được trộn nhanh bằng cách xoay các ống giữa lòng bàn tay.

16. Các nội dung được rót qua năm đĩa thạch cứng tryptone (được dán nhãn 1 đến 5 giọt), do đó tạo thành một chuẩn bị nuôi cấy hai lớp. Các tấm được xoay nhẹ nhàng và cho phép cứng.

17. Các đĩa được cấy được ủ ở vị trí đảo ngược ở 37 ° C trong 24 giờ trong tủ ấm.

Quan sát:

1. Tất cả các tấm được quan sát cho các đơn vị hình thành mảng bám (PFU) phát triển thành vùng rõ ràng trên bãi cỏ của vi khuẩn. Sự hình thành mảng bám là dấu hiệu cho thấy sự hiện diện của coliphage trong nuôi cấy.

2. Mỗi mảng bám thể hiện sự phát triển phong phú của coliphage bị cô lập.

3. Số lượng mảng được tính trong tất cả các tấm và được lập bảng như sau (Bảng 8.1).

Bảng 8.1: Quan sát số lượng coliphage :