Các bước tham gia vào phản ứng chuỗi polymerase trong chuỗi DNA

Một số bước chính liên quan đến phản ứng chuỗi polymerase trong chuỗi DNA là: 1. Bước 1: Biến tính bằng nhiệt 2. Bước 2: Ủ mồi cho chuỗi mục tiêu 3. Bước 3: Mở rộng 4. Bước 4: Kết thúc chu trình PGR đầu tiên .

Phản ứng chuỗi polymerase (PGR) khuếch đại một đoạn DNA duy nhất qua một số bậc độ lớn, xem hình 6.2. Đó là việc tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của chuỗi DNA cụ thể.

PGR là một quá trình hoặc chu trình ba bước. Nó được lặp lại một số lần xác định. Khi chu trình PGR bao gồm các bước này là Biến tính, Ủ và Mở rộng. Một thiết bị tự động điều khiển quá trình diễn ra trong một chu trình nhiệt, nhiệt độ thay đổi trong khoảng thời gian được lập trình cho số chu kỳ PGR thích hợp.

1. Bước 1: Biến tính bằng nhiệt:

Nhiệt thường cao hơn 90 độ C khi tách DNA sợi đôi thành hai sợi đơn. Quá trình này được biết đến như là sự biến tính của người Viking. Các liên kết hydro liên kết các bazơ với nhau là yếu, do đó biến tính là có thể. Các liên kết hydro bị phá vỡ ở nhiệt độ cao, trong khi liên kết giữa deoxyribose và phốt phát, vẫn còn nguyên vẹn vì chúng vẫn còn nguyên vẹn.

2. Bước 2: Ủ ủ Primer cho chuỗi mục tiêu:

Mục tiêu cuối cùng của PGR là tái tạo chuỗi mục tiêu gồm khoảng 100-600 cặp cơ sở duy nhất cho sinh vật được nghiên cứu. Nhắm mục tiêu trình tự được thực hiện bằng cách sử dụng mồi. Mồi đánh dấu sự kết thúc của chuỗi mục tiêu.

Các mồi thử nghiệm AMPLICOR® là các chuỗi ngắn, tổng hợp của chuỗi DNA đơn thường bao gồm 20-30 bazơ, với đầu 5 bi được gắn nhãn biotin để hỗ trợ phát hiện. Đối với vùng mục tiêu của sinh vật, PGR cụ thể của chúng có hai mồi, một cho mỗi chuỗi DNA đơn bổ sung được tạo ra trong quá trình biến tính chuỗi DNA đơn được tạo ra trong quá trình biến tính.

Sự bắt đầu của chuỗi mục tiêu DNA quan tâm được đánh dấu bằng các đoạn mồi ủ (liên kết) với trình tự bổ sung. Việc ủ thường diễn ra trong khoảng từ 40 độ C đến 65 độ C, tùy thuộc vào độ dài và trình tự cơ sở của mồi.

3. Bước 3: Gia hạn:

Nhiệt độ được tăng lên khoảng 72 độ C sau khi mồi bắt đầu trình tự DNA bổ sung. Ngoài ra, enzyme Taq DNA polymerase được sử dụng để tái tạo các chuỗi DNA. Taq DNA polymerase là một DNA polymerase ổn định nhiệt tái tổ hợp từ sinh vật Thermus thủy sinh chúng ta và không giống như các enzyme polymerase bình thường hoạt động ở nhiệt độ cao.

Quá trình tổng hợp tổng hợp các phân tử DNA sợi kép mới, cả hai giống hệt với vùng DNA đích sợi kép ban đầu, bằng cách tạo điều kiện cho sự liên kết và nối của các nucleotide bổ sung không có trong dung dịch (dNTPs). Sự mở rộng luôn bắt đầu ở đầu 3 của đoạn mồi tạo thành một chuỗi kép trong số hai sợi đơn. Taq DNA polymerase tổng hợp độc quyền theo hướng 5 ′ đến 3.

4. Bước 4: Kết thúc chu trình PGR đầu tiên:

Hiện tại có hai chuỗi DNA mới giống hệt với mục tiêu ban đầu ở cuối chu kỳ PGR đầu tiên. Các sợi mới được hình thành có một khởi đầu, được xác định chính xác bởi đầu 5 của mồi, nhưng đầu 3 không được xác định chính xác.

Chuỗi DNA được tổng hợp từ một mẫu như vậy sau đó có độ dài được xác định chính xác bị giới hạn ở một trong hai đầu của mỗi hai mồi. Những chuỗi DNA này được gọi là AMPLIGON. Các chuỗi DNA tương ứng với chuỗi mục tiêu. Chỉ sau một vài chu kỳ, có mặt với số lượng lớn hơn nhiều sau đó các chuỗi độ dài thay đổi. Trình tự bên cạnh hoặc được xác định bởi hai mồi là phần được khuếch đại.